微生物与植物表型(产量等其它性状)的关联分析
1.Abstract
- 对根微生物与寄主植物生长之间的功能联系了解甚少
- 本研究调查了谷子的根细菌群落及其对寄主植物的生产力潜在的作用
- 通过16S rRNA基因扩增子测序，对2个地理位置分离良好的小米Rhizoplane、根际和相应Bulk soil的2882份样品进行了细菌组成测定
- 我们确定了16 109个操作分类单元(OTUs)，并将187个OTUs定义为共享rhizoplane核心OTUs。
- β-diversity分析发现,微生境是塑造谷子根细菌社区的主要因,其次是地理位置
- 大规模关联分析确定了与植物高产有关的潜在有益菌。
- 此外，功能预测揭示了小米Rhizoplane菌群富集的具体途径
- 我们系统地描述了谷子的根系细菌群落结构，发现了谷子的Rhizoplane细菌核心成员
作者首先简单概括了根系微生物的功能，然后引出了本文的主题(对根微生物与寄主植物生长之间的功能联系了解甚少)，然后作者对文章的主要结论进行了总结，以及本研究的潜在用处
2.Introduction
- 根系微生物群是如何影响植物生长和产量的仍然是一个很大的未知数。为了识别有益或有害的微生物，需要对根系微生物群和作物性状进行全面的关联研究
- 本研究对生长在杨凌和张家口两地的1219个谷子品种的根际和根平面菌群进行了测定
- 我们评估了地理位置和微生境对根细菌群落的影响，并根据它们的分类预测了根细菌的功能
- 我们对根平面菌和谷子生产力性状进行了系统的关联分析，鉴定了与寄主植物生产力相关的特定细菌类群
作者同样首先介绍了微生物的功能，然后引出在谷子方面微生物群体研究缺少的地方，然后对所用的材料进行简要的介绍，然后简要介绍了本文的主要研究，和Abstract差不多
3.Data description
- 我们记录了12个与生长和生产力相关的谷子性状
- 我们对16S rRNA基因的V4-V5区域进行了2882个样本的测序，得到了98 750 591个高质量reads供后续分析，平均每个样本34 264个序列。在丢弃低丰度和非细菌操作分类单元(OTUs)后，我们得到了16 109个OTUs，每个样本2998个OTUs
- 根围和根际含有大量的总otu，每个样本中只有30和26个otu的相对丰度高于平均0.5%
不同样品OTU不同分类水品的统计
在谷子根系和土壤中检测到占优势的细菌门
其中Figue1并非是前十个门类的丰度水平的展示
4.Results
4.1影响根相关细菌组成的主要因素
- Chao1指数的稀疏曲线表明，测序深度足以覆盖单个样本的细菌多样性
- 从根际α-diversity减少rhizoplane在这两个领域,(Wilcoxon signed rank test, P < 0.001)
- 利用UniFrac距离评价地理位置和微生境对谷子根系微生物群落结构的影响
- 根平面和根际微生物区系沿第一主坐标分离(图2)。第二主坐标由地理位置来解释
小米根系微生物群PCA分析
图2结果表明，微生境和地理位置对谷子根系的微生物区系变异起主要作用 - CAP分析结果展示,微生境解释了最大比例(26.05%,P < 0.001)的β-diversity的变化,其次是地理位置，基于UniFrac距离的PERMANOVA对这一模式进行了recapitulated
- 张家口根际与根平面菌群的相似性显著高于杨凌 (Sørensen–Dice index and Morisita-Horn’s index,
Wilcoxon signed rank test, P < 0.005)
不同地理位置根围和根际微生物群落结构差异分析
根据[10]三步富集模型，我们的结果表明，在这两个采样点，宿主对根际菌群的影响是不同的，这可能是由于相应的土壤特性造成的
4.2Core rhizoplane bacteria
- 我们分别从杨凌和张家口的根系菌群中分析出329和456个根系核心菌群，每组样品中存在超过80%的根系菌群，根围菌群与根际菌群相比有统计学意义上的富集(Wilcoxon signed rank test, Benjamini-Hochberg adjusted P <0.01)
- 在两个地点共有的187个核心Rhizoplane OTUs，有144个属于杆菌门、放线菌门、根瘤菌门、伯克霍尔德门和Sphingobacteriales细菌门(作者对核心菌群进行了Veen图分析，并且对主要门类的结果进行了分析）
Rhizoplane核心菌群的特性分析
上图(b)的分类水平展示图片挺好看的 - 与土壤和根际样品相比，根围样品中减少的细菌门主要是酸杆菌门，杨凌的酸杆菌门相对丰度从块状土(16.74%)下降到根际(11.95%)和根平面菌群(3.63%)(Wilcoxon秩次检验，P < 0.005)。
首先分析核心Rhizoplaned整体的分布情况，然后对两地的Rhizoplane核心菌群进行了比较分析，并且将Rhizoplane的样品分布情况和根际进行了比较。
4.3Root bacteria correlated to foxtail millet growth and productivity
- 由于杨凌数据集样品量大，作者首先利用杨凌数据集评估了根围菌群和谷子性状之间的相关性
- 作者发现，Rhizoplane菌群与主茎的穗重、单株粒重、顶二叶宽、主茎宽和主茎的穗径显著相关(Benjamini-Hochberg adjusted P < 0.05, PERMANOVA and the Mantel test)
- 同时，这些性状之间相互联系，共同代表了植物的一般性状
- 作者重点研究了Rhizoplane菌群与单株粒重的相关性，这是反映理论产量的典型特征
-
在709个Rhizoplane样品中，用839个otu训练了一个随机森林模型（occurrence frequency ≥0.3 and adjusted P < 0.05, Spearman’s rank correlation test），在训练集中进行了5次重复的10倍交叉验证(即50次试验)，最终选择了75个OTU标记用于每株作物的粒重，确定了OTUs与单株粒重之间的相关关系(R2= 0.31)
随机森林模型
- 结果表明，谷子产量是植物遗传和根围菌群共同作用的结果。植物通过主动或被动地调节有益和有害的根微生物来适应环境
- 与产量正相关的细菌形成了具有强斯皮尔曼相关性的复杂网络，而与产量负相关的细菌则呈现出简单的弱连接网络，如下图所示。下图的结果表明，潜在的有益菌往往同时出现在谷子根区，而非有益菌没有形成密切的相关性。
谷子根平面微生物中标记OTUs的共现网络
Marker OTUs相对丰度对粒重的热图和层次聚类分析
作者首先利用Benjamini-Hochberg adjusted P < 0.05, PERMANOVA and the Mantel test确定菌群和谷子性状的相关性，然后利用随机森林的方法确定和性状关联的菌群，最后对这些关联的菌群进行了共现网络的分析
4.4Functional prediction and comparison between rhizosphere and rhizoplane microbiome
-
作者利用PICRUSt软件包预测了小米根系微生物组的功能图谱，根际和根平面菌群丰富了不同的Kegg形态，并且评估了不同的scores
KEGG通路在Rhizoplane或Rhizsphere样品中的富集情况的分析
- 在杨凌和张家口，Rhizoplane和Rhizosphere相比有12条特定的KO途径被显著富集 (Z-score ≥ 2.3, adjusted P < 0.01)(上图b)
- 磷转移酶系统(PTS)在Rhizoplane菌群中显著升高,可能促进根平面细菌主动吸收降解的单糖从植物根部渗出和沉积物中
- ABC转运系统在Rhizoplane菌群中也得到了提升，这可能有助于从密集堆积的Rhizoplane细菌中进行分子、氨基酸、维生素B12或铁复合物的复杂交换
- 此外，2个组分系统通路-群体感应基因(qseC)、细菌趋化感测相关基因(aer, pilJ)、表面接触信号感应基因(wspA)、生物膜形成相关基因(rpfC)、能力因子(comX)在Rhizoplane菌群上富集，这些途径负责细胞间信号，协调细菌行为、宿主定植和应激生存以监测种群密度
- 有趣的是，我们观察到与根际相比，根平面微生物体内色氨酸代谢途径的丰度增加，吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid, IAA)是许多植物促生长根菌(plant - growth - rhizobacteria, PGPR)产生的l -色氨酸代谢的共同产物。
- 外源性生物降解和分解代谢途径主要存在于Rhizoplane菌群中
- 结果显示普遍的代谢途径对应KEGG类别“外源性物质生物降解和代谢”表明,狐尾Rhizoplane细菌微生物可能选择酶能够适应降低人为的化学物质,杀虫剂和除草剂等,和其他环境污染物可能广泛的目标地区的土壤中
- 以往的研究报道，许多土壤细菌，包括Nocardia、Streptomyces、Rhodococcus能够降解多种稳定的外源性生物，如多环芳烃、苯甲酸盐、氯酚等
- 综上所述，我们的研究结果为谷子和其根部共生细菌的相互作用提供了重要的认知。宿主植物通过根系分泌多种有机分子“影响”细菌;作为回报,根细菌可能以多种方式有益于植物的健康和生产力，如产生重要的植物激素或降解有害化学物质
作者首先预测了不同部位的微生物的功能，然后对其对应的功能分别在不同的地点、不同的根系位置的功能差异进行分析，将功能差异对应到菌群种和宿主上
5.Discussion
- 我们主要描述小米根菌群的分类结构，主要包括:酸杆菌、放线菌、拟杆菌、厚壁菌和变形菌,小米Rhizosphere到Rhizoplane微生物区系的多样性下降(Wilcoxon signed rank test, Benjamini-Hochberg adjusted P <0.01)
- 在本研究中，CAP和PCoA (principal coordinates analysis, PCoA)均表明微生境是影响细菌微生物群落的主要因素，而不是地理位置.
- 采用类似于人类相关研究的方法，分析了谷子粒重与根平面菌群的相关性[39][40]
- 由于作物产量与多个基因相关，与一些与单个基因相关的性状相比，利用全基因组关联研究(GWAS)来识别这些关键基因/单核苷酸多态性比较困难,根相关微生物群落作为生物因子的主要代表，对植物生长发育的重要性已被广泛认识[41],[42]
- 有趣的是,作者发现与产量正相关OTUs表现出了一个强大而复杂的相关网络，而负相关OTUs表现出了一个更为松散和简单的网络，协同微生物相互作用可能在植物微生物群落的组装过程中发挥重要作用，有利于植物的生长发育。
- 作者发现与养分吸收、环境反应和密度控制相关的大量代谢途径在根表面的菌群中富集，而与碳固定和氨基酸合成相关的许多代谢途径在根际的菌群中富集
总结下，本研究系统地对谷子的根系细菌菌群进行了特征描述，发现了潜在的有益根系细菌和基因组途径，为有益根系细菌在农业改良中的应用提供了基础，另一方面，作者将对根样本进行宏基因组测序，这将比预测数据更准确地提供根微生物的定性和定量功能信息。这将有助于我们进一步了解根区的微生态系统。
Materials and Method
Read processing and OTU construction
- OTUs whose relative abundance was higher than 0.01% in at least 1 sample were used to generate the profile
- 为了评估不同因素对beta多样性的影响，我们还使用R Package vegan
v. 2.3.3. 中的capscale()函数对主坐标(CAP)进行了典型分析，因子的变异和显著性由anova.cca()函数计算，其中by =“term”使用999个排列。 - 用两种方法测定了各品种根际和根际的群落结构差异：the Sørensen–Dice index and Morisita’s overlap index（Wilcoxon signed rank test with P < 0.05）
Core OTUs
- 为了探究Rhizosphere和Rhizoplane的微生物群体的差异利用 Wilcoxon signed rank test 对commom OTUs(出现在80%的样品中)进行了检验，p值利用Benjamini and Hochberg (BH) 的方法进行了矫正
Association study
- 采用两种方法研究了杨凌小米Rhizoplane微生物群落与小米表型的关系：
1.PERMANOVA was performed using the function adonis() in the R package vegan v. 2.3.3 and the permuted P value was obtained based on 999 permutations for the growth and yield traits.
- mantel test which was implemented as mantel() in the R package ecodist v1.2.9, was used to identify correlations between microbial community and phenotypes.
- 所有表型性状之间的相关性采用Spearman秩相关计算，并使用R包
corrplot表示Spearman相关系数的颜色梯度(v. 0.77)。 - 关于随机森林模型的分析，在杨凌的1013个样本中，随机选取709个样本来训练预测模型，其余样本用来检验模型的适应度.(ntree = 1000 and nodesize =15),采用10次交叉验证的方法确定与粒重相关的最佳OTU集.
- 根据杨凌rhizoplane样品中任意2个标记物OTUs的丰度，计算各标记物间的Spearman相关系数
- The co-occurrence network was visualized by Cytoscape 3.3.0 Cytoscape
Microbial function prediction
- 利用PICRUSt软件进行微生物功能预测
- 得到的OTU丰度表用16S rRNA拷贝数进行归一化，预测宏基因组功能用predict metagenome .py(qiime1)进行预测
- KEGG的分析参考57,采用1-tail 的Wilcoxon秩和检验和BH校正法鉴别差异富集的KOs,Z≥1.64(正态分布95%可信)的报告值可作为显著差异通路的检测阈值
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