文献解读：儿童发生β细胞自身免疫的早期DNA甲基化变化 | 糖尿病研究
1型糖尿病是一种病因复杂的慢性自身免疫性疾病，表观遗传调控是其重要的潜在致病因素。以往的表观基因组学研究主要集中在临床诊断的个体上。本研究目的是评估与1型糖尿病相关的早期DNA甲基化变化，这些变化出现在临床诊断之前甚至在出现自身抗体之前。
标题：Early DNA methylation changes in children developing beta cell autoimmunity at a young age
期刊：Diabetologia
影响因子：IF 10.122
发表时间：2022.02.10
技术平台：RRBS、RNA-seq、焦磷酸测序
方法：
作者采用简化代表性重亚硫酸盐测序（RRBS）技术，对226个外周血单核细胞样本的纯化CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD4-CD8-细胞组分的DNA甲基化水平进行研究。实验样本从7例1型糖尿病特异性自身抗体阳性患者和年龄、性别、HLA风险、出生地相匹配的对照组人群中纵向采集。同时，作者通过RNA-seq对同一样品的DNA甲基化和基因表达进行关联分析，最后使用焦磷酸测序对RRBS结果进行技术验证。
图1：研究设计和分析工作流程
结果：
作者在1型糖尿病特异性自身抗体阳性患者样本和对照组样本间的 CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD4-CD8-细胞组分中分别鉴定出79、56和45个差异甲基化区域。血清转换前样本分析确定了疾病早期的DNA甲基化特征，包括CD4+T细胞中IRF5启动子的差异甲基化。此外，作者利用CpG位点的焦磷酸测序验证了RRBS结果：chr19:18118304位于 ARRDC2启动子中；chr21:47307815位于PCBP3内含子中；chr14:81128398位于CD4+T细胞中TRAF3附近基因间区。
图2：RRBS数据分析差异甲基化的CpG位点（DMCs，differentially methylated CpG sites）
（1）不同细胞组分的RRBS分析鉴定1型糖尿病风险儿童的甲基化差异
表1：所有纵向样本中，实验组和对照组主要DMCs（FDR <0.0001）
（2）大多数DMR呈细胞类型特异性
图3：不同细胞组分中检测到的DMR维恩图
（3）DMR分布在不同的基因组区域
图4：1型糖尿病相关DMR
（4）甲基组&转录组关联分析揭示甲基化和基因表达高度相关，突出目标候选基因
表2：DMCs与基因表达水平关联分析（Spearman等级相关系数&amp;gt;| 0.5 |）
图5：甲基化和基因表达关联分析
（5）血清转换前分析揭示1型糖尿病早期DNA甲基化差异
图6：血清转换前的DNA甲基化分析
（6）焦磷酸测序对RRBS结果进行技术验证
表5：重亚硫酸盐焦磷酸测序验证RRBS结果
结论：
这些初步结果为基因的细胞类型特异性差异表观遗传调控提供了新的见解，可能有助于揭示1型糖尿病早期阶段的发病机制，与1型糖尿病相关的早期DNA甲基化水平的鉴定可能成为疾病预测和管理的潜在标记。
DNA甲基化研究思路总结
DNA甲基化组学研究的核心内容在于对DNA甲基化数据的挖掘。DNA甲基化一般遵循三个步骤进行数据挖掘。
首先，进行整体全基因组甲基化变化的分析，包括平均甲基化水平变化、甲基化水平分布变化、降维分析、聚类分析、相关性分析等。
其次，进行甲基化差异水平分析，筛选具体差异基因，包括DMC/DMR/DMG鉴定、DMC/DMR在基因组元件上的分布、DMC/DMR的TF结合分析、时序甲基化数据的分析策略、DMG的功能分析等。
最后，将甲基化组学&转录组学关联分析，包括Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、网络关联等。
可以有下游实验验证。
本研究使用的RRBS技术
简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。
为了适应科研技术的需要，进一步开发了可在更大区域内捕获CpG位点的双酶切RRBS(dRRBS)，可研究更广泛区域的甲基化，包括CGI shore等区域。
为助力低样本量多维度分析，开发了富集覆盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点的甲基化靶向测序方法：XRBS，实现了高灵敏度和样本复用，使其具有高度可扩展性，并适用于有限的样本和单个细胞。
WGBS、cfDNA-RBS、RRBS技术位点覆盖对比
参考文献：doi: 10.1007/s00125-022-05657-x
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