近期小博在整理一些高分文章，学习相关的思路和方法。俗话说得好“独乐乐不如众乐乐”，分享才是最好的沟通方式。那么接下来跟随小博的步伐深入了解一些高分文章的思路。ps：千万别掉队哦~
文章：FAF1 Regulates Antiviral Immunity by Inhibiting MAVS but is Antagonized by Phosphorylation upon Viral Infection.
期刊：《Cell Host Microbe》
影响因子：17.872
该文章研究的是支架蛋白（FAF1）与线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）和抗病毒免疫之间的联系，我们来看文章的具体内容：
1 、首先作者通过质谱（MS）分析将FAF1鉴定为MAVS相关蛋白，利用免疫共沉淀来验证FAF1和MAVS之间的相互作用关系。
通过将FAF1蛋白的结构域（C末端的UBX结构域、N末端的UBA结构域和或泛素样结构域）敲除，探究FAF1与MAVS的作用位点，结果表明FAF1与MAVS结合不需要UBA和UBX结构域，而UBL结构域的丧失完全消除了FAF1与MAVS的相互作用。
接着经SeV病毒处理后，细胞内FAF1聚集体和FAF1蛋白的总水平显著下降，表明FAF1的聚集体结合并拮抗线粒体上的MAVS，其可以通过病毒感染而减弱。
【这些结果表明，通过其UBL结构域，FAF1形成大的SDS抗性复合物，可与MAVS结合并抑制先天抗病毒免疫】
2 、CRISPR-Cas9介导的基因组编辑构建Faf1fl/fl小鼠模型（Faf1+/+和Faf1-/-），制备了原代腹膜巨噬细胞，并用SeV病毒或VSV刺激它们。
与野生型巨噬细胞相比，用SeV处理后，在Faf1-/-巨噬细胞中Ifnb1、Cxcl10和Ccl5基因以及IFN-b蛋白的表达显著上调。。
经VSV感染后，与Faf1+/+小鼠相比，Faf1-/-小鼠的肺，脾和肝中Ifnb1 mRNA水平和血清中IFN-b蛋白水平显著增加，而VSV特异性mRNA、VSV-G蛋白表达和VSV滴度则显著下降，表明Faf1-/-小鼠对VSV感染的抵抗力更强。。
为了说明FAF1对先天抗病毒免疫的影响，作者通过用LysM-Cre小鼠繁殖Faf1 floxed（Faf1fl / fl）小鼠来条件性消除巨噬细胞中的FAF1。结果表明Faf1fl/fl Lyz-2-Cre+巨噬细胞中VSV-G蛋白和病毒滴度远低于野生型巨噬细胞。其他与前文Faf1-/-小鼠结果一致。
【这些体内数据表明FAF1是针对RNA病毒的抗病毒免疫应答的重要负调节物】
3 、作者进一步研究了FAF1抑制先天免疫的机制。
FAF1 WT的过表达，可以抑制Faf1-/-细胞中IFN-b蛋白的上调。除此之外，MAVS下游的关键病毒诱导的分子事件（TBK1和IRF3磷酸化和IRF3二聚体形成）在Faf1-/-型巨噬细胞中都被加强，并且在异位表达FAF1的细胞中被抑制。所有这些结果都表明FAF1通过MAVS水平的干扰抑制IFN-b信号传导。。。
接下来分析了FAF1对MAVS与RIG-1和TRIM31之间结合的影响，发现FAF1对RIG-1和MAVS之间结合的影响，但是MAVS和TRIM31之间的结合降低。Sev病毒感染的时程分析显示MAVS和FAF1之间相互作用的减少伴随着MAVS与TRIM31结合的增加，表明这些事件是偶联的。。
此外，FAF1对MAVS和TRIM31之间相互作用的抑制作用表明FAF1通过TRIM31干扰MAVS的赖氨酸63-连接的多泛素化。缺乏FAF1的MEF显示SeV感染后MAVS的赖氨酸63多聚泛素化增加。
【这些结果表明FAF1通过破坏病毒诱导的TRIM31和K63连接的多泛素化结合来抑制MAVS水平的先天免疫信号传导】
4、 接下来作者发现MAVS的聚集被FAF1 WT，d_UBA或d_UBX的异位表达抑制，而不是通过FAF1 d_UBL抑制。此外，在病毒感染后，与Faf1+/+ MEF和Faf1fl/fl Lyz2-Cre-相比，Faf1-/- MEFs和Faf1fl/fl Lyz2-Cre+巨噬细胞显示出内源性MAVS的聚集增加。
此外，SeV病毒感染显著降低了FAF1表达，并将MAVS和TRAF2/6从低分子量片段转移至高分子量片段聚集，以及Faf1-/-巨噬细胞裂解物中的MAVS和TRAF2/6蛋白更大程度上聚集在高分子片段中。。
与此相符，SeV病毒感染后，Faf1-/-巨噬细胞中Il-6，Tnf-a，Il-1b和Nos2的分泌显著升高。
【所有这些表明FAF1抑制MAVS介导的信号传导】
5 、作者进一步研究了病毒感染后FAF1蛋白水平降低的机制。
作者发现溶酶体抑制剂（NH4Cl或氯喹）抵消了FAF1的减少，而MG132或lactasystin的蛋白酶体抑制则没有。在免疫荧光分析中也显示出同样的结果。。
【这些结果表明FAF1靶向病毒感染后的溶酶体降解】
接着通过CRISPR/Cas9技术分析了TBK1和/或IKBKE（编码IKKƐ）中单或双缺陷的HEK293T细胞中FAF1的表达。结果发现IKKƐ的缺失完全阻止了由SeV感染引起的FAF1的降解。。
【这些数据一起表明病毒感染可以通过IKKƐ介导的磷酸化诱导FAF1的溶酶体降解】
随后利用质谱分析了IKKƐ靶向的特异性磷酸化位点，发现Ser556是IKKƐ诱导迁移变化的最关键残基。。此外，FAF1突变体S556A显著地抑制了MAVS和IKKƐ诱导的IFN-b启动子活性。。
接着通过敲除IKKƐ来验证Ser556是否为特异性磷酸位点，结果发现敲除IKKƐ完全阻断由SeV或VSV感染引起的FAF1的Ser556磷酸化。。
【这些结果表明内源性IKKƐ在体内介导SeV诱导的Ser556处FAF1的磷酸化】
6 、然后进一步研究了IKKƐ介导的Ser556磷酸化的具体机制。
通过质谱分析显示Lys139，Lys143，Lys146和Lys221在IKKƐ共表达时作为特异性乙酰化位点，并且所有这些赖氨酸残基位于FAF1 UBL结构域中，暗示IKK Ɛ介导的Ser556磷酸化可能在UBL结构域中触发FAF1乙酰化。
为了进一步检查UBL乙酰化是否依赖于Ser556磷酸化，作者通过在不存在或存在4KR突变（S556D / 4KR）的情况下将Ser556突变为Asp（S556D）来构建磷模拟构建体。结果表明S556D突变体聚集显著降低，但是同时突变UBL结构域中的四个赖氨酸乙酰化位点可以改善这一现象。
【IKKƐ介导的Ser556磷酸化通过诱导FAF1的UBL结构域中四个特定赖氨酸残基的乙酰化而不是阻断FAF1-MAVS相互作用来促进FAF1去聚集。】
好了，文章就到这结束了，做个总结：
1> FAF1形成负调节MAVS和先天抗病毒免疫应答的聚集体；
2> FAF1破坏MAVS和TRIM31之间的关联以抑制MAVS活化；
3> FAF1聚集取决于抑制MAVS所需的UBL结构域；
4> 活化的IKKƐ在Ser556处磷酸化FAF1，其使FAF1解聚并降解。
总的来说就是：FAF1形成聚集体并抑制赖氨酸63-连接的多泛素化和MAVS聚集，从而抑制先天抗病毒免疫。然而，在病毒感染后，FAF1被IKKƐ直接磷酸化，阻止其聚集并因此激活抗病毒免疫。
文章中涉及到的实验技术很全面（包括质谱分析、CRISPR-Cas9基因编辑、免疫荧光、半变性琼脂糖凝胶电泳、Faf1fl/fl小鼠模型构建等），可以说是环环相扣，引人入胜。当初小博看的时候是根本停不下来。各位看官，有什么想法欢迎评论下方留言沟通哦！！！
• END •
网友评论