6.2.2.2蛋白质的BRET标记
FRET和BRET的一个关键区别在于，在使用BRET时，GPCR的cDNA序列以及被研究的可能的相互作用蛋白需要与编码发光体酶或荧光团的cDNA进行基因融合。荧光蛋白免疫标记用于BRET检测理论上是可行的；然而，想找到针对待测蛋白质可用而又特异的抗体却是难上加难。GPCRs的羧基(C)端通常用于研究细胞内蛋白质相互作用。然而，只要标签不干扰蛋白质的正常结构折叠或生理功能，标签可以被整合到蛋白质的任何合适区域。如果已知受体或蛋白质的N和C端都参与了已知过程的结构或功能，这可能是特别有益的。在每个蛋白质上偶联的BRET标记的类型将取决于所采用的特定BRET方法，这将在第6.2.2.9节中进行更详细的讨论(见下表)。
应用分子生物学技术将BRET标记与编码GPCR或研究中假定的相互作用蛋白的cDNA序列整合同一个编码区(见下图)。这一过程中会用到：合适的克隆载体与寡核苷酸引物、限制性内切酶、连接酶以及扩增每个融合蛋白编码载体的细菌细胞。因此，这两种被研究的蛋白质的cDNA序列必须是已知的。
假定的相互作用蛋白的大小相对于发光团或荧光团BRET标签的大小应予以考虑。发光团Rluc为36kda，而EGFP等荧光蛋白为27kda。这些结构物与相似或小得多的蛋白质的结合可能会影响后者正常的生理功能。最近，研究发现在MC2R的c端融合绿色荧光蛋白(GFP)会导致正常功能的MC2R不能正确插入质膜。另一方面，如果蛋白质远远大于BRET标签，相互作用可能会因为距离过大使得RET无法被探测到或者很弱。质可以利用BRET标记和蛋白之间添加 的linker区域增加自由运动度以抵消距离问题，还能够将BRET标记与感兴趣的蛋白质功能域分割开来。一系列可能的对GPCRs的检测可用于确定功能的损失或增加是否归因于BRET标记的融合。研究这些方面的机制将在第6.2.2.3节中进一步阐述。
6.2.2.3 BRET融合蛋白的验证
确定由于添加BRET标记而引起的蛋白质功能属性的变化对于产生有意义的结论是至关重要的。从BRET实验中产生的任何数据都必须根据蛋白质活性的可能差异来解释，通过与未标记的或原生的形式功能相比较。为了测试片段标记的GPCRs的功能，一种常用的方法是测量激动剂产生第二信使的效力/功效。为了实现这一目的，可以将BRET标记的GPCRs激活产生的剂量响应曲线与野生型GPCR进行比较。测定方法可用于测量通常产生的第二信使，如肌糖磷酸和环磷酸腺苷。由于GPCRs主要存在于质膜，共聚焦显微镜通常是一种很好的方法，可以直观地确认受体能够充分运输到细胞表面。发光标记的GPCRs(即供体)可以直接显示；然而，荧光标记的GPCRs(即受体)可能需要附加免疫化学标记，如myc、FLAG或血细胞凝集素，并使用合适的抗体进行标记。共聚焦显微镜还可以用来显示假定的相互作用蛋白的活性是否受到损害，特别是当该蛋白应定位于特定的细胞间隔时。免疫化学标记的融合也可用于检测，如酶联免疫吸附检测(ELISAs)。基于细胞的ELISAs在确定蛋白的膜表达方面尤其有益。根据特定蛋白质的功能，研究者可自行决定是否进行其他检测。
6.2.2.4 BRET
表达系统及融合蛋白转染
在BRET融合cDNA构建完成后，需要一个合适的表达系统来合成这两种蛋白。值得注意的是，某些细胞系可能含有内源性的被研究的蛋白质，这可能通过为标记的蛋白质提供竞争而影响BRET信号。内源性蛋白水平通常可以通过western
blots来评估，在解释结果时应考虑任何此类发现。外源细胞系如HEK293或COS-7细胞是常用的；然而，在这些细胞中发现了一系列内源性GPCRs[64]，在解释BRET数据时可能需要考虑这些因素。
融合蛋白在不同细胞类型中的表达需要使用合适的转染方法。对于哺乳动物细胞来说，一个例子就是利用阳离子脂类来帮助DNA穿过双脂质膜进入细胞浆。重要的是，转染试剂应测试效率和细胞毒性与特定哺乳动物细胞系使用。通过使用针对cDNA构建中存在的可选择标记的抗生素，可以实现成功转染细胞的基本选择；然而，在BRET试验需要双转染的情况下，针对每个BRET融合构建物使用两种抗生素将是更好的选择。
哺乳动物细胞瞬时转染融合蛋白编码cDNA可以导致广泛的蛋白表达水平。瞬时cDNA转染适合于大多数BRET实验；然而，如果感兴趣的蛋白表达不佳，那么产生稳定转染的细胞可能是一个更好的选择。稳定的细胞系是通过连续选择已成功转染一个或两个BRET标记的cDNA结构的细胞产生的。这种方法应该减少蛋白质表达的变异范围，优于观察到的瞬时表达的细胞群体。单克隆而非多克隆稳定细胞系的产生是首选，因为这将进一步降低蛋白质表达的可变性。应该注意的是,一些cDNA表达会比其他蛋白更高,由于其超表达可能等同于其他构建由于约束而造成的低表达。在选择合适的cDNA转染量和比例时，应该考虑到这一点。
BRET检测系统的一个缺点是蛋白质的增强表达或过表达，其数量可能大于生理上观察到的。这可能导致获得人工BRET信号，其仅仅是由于供体和受体融合蛋白的接近。另一种方法可能是针对特定设计的受体细胞系，对BRET融合蛋白序列进行同源重组，以产生同基因稳定细胞系。这项技术已经在一项研究中用于研究一种特殊的GPCR-蛋白相互作用[5]的影响，但尚未用于BRET试验。它的使用可能导致更好的控制和更多的生理相关水平的表达蛋白。对于BRET检测，可以使用一些方法来测量这些在细胞群中的表达水平，这些方法将在下节中讨论。
6.2.2.5
蛋白表达测定方法
在BRET实验中，细胞中供体和受体蛋白浓度的相对测量对于结果的分析和解释至关重要。重复具有较低分析间变异性的BRET试验的能力对产生有意义的结论是有统计学意义的。如果待测的GPCR或蛋白质融合了一个合适的抗原决定簇,可以用细胞ELISA技术可以用来比较两个细胞群之间的GPCR细胞表面表达，如果采用了合适的透化剂，还可以检测细胞内GPCR/蛋白的水平。从而可以获得蛋白表达比率。通过使用适用于所使用荧光探针的带通滤波器测量预定数量的细胞发出的总荧光，还可以确定受体荧光的相对水平。或者，可以使用膜制剂或转染细胞的纯化蛋白提取物来测定供体或受体蛋白的绝对水平。该分析所需的方程、方法和变量此前已确定，但未用于BRET试验。转染细胞的荧光或发光强度可以用荧光计或带有合适的带通滤光器的发光计或扫描光谱仪来测量。另外，荧光激活细胞分选(FACS)能够确定表达细胞的百分比和每个细胞的受体浓度水平。推而广之，这一过程可用于纯化含有一定期望水平的蛋白质表达的细胞。除非合适的荧光偶联抗体能够靶向供体蛋白，否则无法使用该技术测定供体蛋白的表达。可能需要将免疫化学标记结合到供体蛋白上，以测量Rluc标记蛋白的浓度并帮助确定供体蛋白的表达。
6.2.2.6 选择BRET标记蛋白的最优表达
建立供体和受体BRET标记蛋白的最优比例对于获得明显的BRET信号以及产生可信结果至关重要。这里存在两个变量：BRET蛋白的总体表达水平和BRET标记供体和受体蛋白的相对表达水平。如前所述，为了减少可能发生的非特异性相互作用，应该将蛋白质过表达的总体水平保持在最低水平。调节受体与供体的表达比例，不仅可以使BRET信号更加明确，还可以用来指示特异性，详见下节。一般情况下，受体与供体蛋白的表达比例应高于1，一般为2:1 ~ 4:1。然而，这还取决于所研究的GPCR-蛋白对的一系列特性，包括GPCR-蛋白相互作用的亲和力、已知或可能的化学计量学关系。例如，泛素化GPCRs的化学计量取决于单泛素化或多泛素化复合物的形成。聚多泛素化蛋白复合物的形成最近被优化用于BRET检测。
重要的是，受体和供体BRET构建体的相对表达水平高度依赖于转染的效率(给定数量的转染受体或供体构建体cDNA所表达的蛋白量)。可以使用上节中描述的技术来确定蛋白质表达的评估；然而，滴定法通常用于确定最佳的受体-供体BRET结构比。
6.2.2.7 BRET特异性的评估方法
供体和受体之间的总浓度和比例的变化
BRET标记的蛋白质通常用于验证GPCR-蛋白相互作用的特异性。已有两种不同的方法来评估GPCR-蛋白相互作用的特异性。
其中一种是饱和或滴定法，可用于测量持续的相互作用和动态相互作用某个单一的时间点。这一技术涉及到固定数量的供体蛋白的表达，以及不断增加的受体蛋白的表达。一个特定的GPCR-蛋白相互作用应该产生一条双曲曲线，其渐近线趋向于最大的BRET值。BRETmax是在高受体与供体比率下，接近水平的BRET比值。这个值表示趋向于一个饱和点，此时所有可用的供体蛋白都与受体蛋白相互作用，这样增加更多的受体蛋白不会导致更多的相互作用。BRET50值通常用来比较GPCR-蛋白相互作用的特异性，指示获得最大BRET值一半所需的受体-供体结合蛋白的比例。相比之下，非特异性的相互作用BRET比和受体与供体比之间的关系则近似线性。
另一种方法是通过增加未标记的“受体”蛋白或另一种非相互作用蛋白的数量，同时保持供体和受体BRET标记蛋白的浓度和比例不变，来置换或竞争受体结合蛋白。如果相互作用是特异性的，那么连续增加未标记的“受体”蛋白的数量将导致BRET比呈s形下降。如果在连续的试验中加入了不断增加的已知非相互作用蛋白浓度，那么对于供体和受体BRET标记蛋白之间的特定相互作用，BRET比值应该保持不变。
虽然这些方法已经被用来为一些GPCR-蛋白相互作用提供证据，但对它们的使用仍存在争议。供体和受体蛋白的过表达是解释这些相互作用的生理相关性的主要考虑因素，而使用严格的对照是至关重要的。
6.2.2.8 BRET对照
使用合适的对照物进行BRET检测对于得出可靠结论至关重要。通常，只表达供体蛋白的细胞作为表达供体和受体的细胞的对照一起被检测。当加入底物后，仅表达供体的对照将指示背景BRET信号。另外，如果一种物质如配体改变了GPCR-蛋白的相互作用，可以使用相应的供体和受体表达的细胞群但不加入配体作为对照。它们与配体或稀释配体的载体平行测量和处理。
所有BRET试验均应采用阳性和阴性实验对照，以确定所获得数据的相关性。阳性对照可能采取已知的GPCR-蛋白相互作用的形式，特别是含有与被测GPCR类似的相互作用。例如，血管紧张素1型受体和β-arrestin 2之间的相互作用在较长一段时间产生强大和稳定的BRET比率，典型的B类受体与β-arrestin结合的表现。
优选的是，阳性对照的BRET配对也应该与被研究的蛋白质在相同的细胞间隔中表达。一个合适的阴性对照应该包括分析与被研究的相互作用蛋白大小、形状和细胞定位相似的蛋白。例如，促激素受体由于缺少一个胞内c端尾部无法结合到β-arrestin，使得这个配对十分适合用来研究GPCR-β-arrestin相互作用。此外，激活状态下的先天血管紧张素2受体无法结合到β-arrestin 2是一个类似的例子，适合做阴性对照。还可通过突变的手段使蛋白功能丧失，无法与被研究的互补蛋白结合，从而作为阴性对照。由于更多的变量(如大小、形状和细胞定位)保持不变，这些变量作为阴性对照可能更有效。
6.2.2.9 BRET方法和程序的选择
目前，已经开发了三种BRET子方法，主要根据使用的基于coelenterazine的底物进行分类。本文开头的表格总结了这些方法，包括使用的底物供体标签和受体标签。重要的是，BRET子方法的选择将直接影响BRET结合的供体和受体蛋白的构建。多种荧光团和多种Rluc突变形式可以优化GPCR和预期的相互作用蛋白之间获得的信号。根据所研究的GPCR-蛋白相互作用对的动态特性，在BRET试验中可以改变两个变量。相对于持续相互作用，在单一时间点测量BRET可能是有益的，例如，与第6.2.2.7节中使用的方法相关联。在这种情况下，可以使用一定浓度的供体和受体蛋白，但测定时间必须保持不变。另一方面，长期的GPCR蛋白动态可以在一段时间内监测，但连续的测量必须在相同的蛋白浓度条件下进行。通常，一旦达到合适的供体和受体蛋白浓度和比例，就可以进行时间-过程研究。
6.3 Troubleshooting
6.3.1蛋白表达低或无表达
•BRET cDNA结构不表达在适用细胞表达的载体中。
•检查构建物的测序，以确定没有突变和/或确保cDNA序列在表达框内。
·优化转染试剂/系统的使用。
•优化转染BRET融合cDNA的数量和比例。
6.3.2 BRET信号低或无
•错误地将蛋白运送到正确的细胞区域(例如，缺乏在细胞表面表达的GPCR)。
•一个或两个BRET融合蛋白的低表达水平。
•次优滤光片组合。
•存在还原剂，导致信号猝灭。
•仪器没有正确校准。
6.3.3可变BRET信号
•BRET融合标签的次优定位(见第6.2.2.2节)。
• eBRET – 底物不能充分溶解 (37°)溶解
•不利的环境条件(即温度和/或二氧化碳浓度)。
6.3.4高背景BRET水平
•次优滤光片组合。
•BRET构造的过度表达，导致旁观者BRET出现。
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