很多在线的gRNA脱靶检测软件，仅限选定的物种，所以对非模式物种来说并不友好。本文选取两个相对简单的脱靶检测软件，CHOPCHOP和CasOT进行脱靶位点的检测。前提是物种需要有公布的基因组序列或注释信息。
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CHOPCHOP
首先在官网界面，输入基因名字或Fasta序列，选择相应的物种，然后点击运行即可搜寻候选的sgRNA。在结果文件页面，包含了10个候选的sgRNA，单击sgRNA进入单独界面，会详细罗列出在全基因组范围内潜在的脱靶位点。
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找寻脱靶位点基因组序列：
首先在NCBI上输入脱靶定位的序列，如NW_011876316，
F)NVUTM%_TG309{AO8YPK~5.png
在基因组中肉眼很难观测到，可以下载下来全序列然后MEGA寻找，当然这些都是最传统的办法，比较便捷的是可以通过NCBI提供的Genome Data Viewer直接查找而无需下载。在页面右侧单击Show in Genome Data Viewer(新建页面，保留原始页面)
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然后选择Tools > Search，输入脱靶的核酸序列，然后找到具体对应基因组的位置，如下图所示：
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本处比对到NW_011876316的945659——945681，然后回到NCBI比对的界面，在右侧的Change region shown，输入选择的区域，这里在我输入的序列在脱靶序列上下游个1000bp，便于后面进行基因扩增检测。
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然后下载下来即可。
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CasOT
CasOT支持本地windows操作，且没有物种限制。软件是用Perl脚本，所以首先安装Perl，然后就是windows命令行本地化运行：
win+R
cmd
E:
cd E:\xjf_data\CasOT-1.0
CasOT-1.0\casot.pl
-t='E:\xjf_data\CasOT-1.0\sgRNA.txt' -g='E:\xjf_data\CasOT-1.0\GCF_000789215.1_ASM78921v2_genomic.fna' -e='E:\xjf_data\CasOT-1.0\GCF_000789215.1_ASM78921v2_genomic.gff' -o=csv -s=2 -n=4 -p=A
参数详见文档说明，或-h查看。
运行大约5分钟即可出结果。
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