自2020年登上Nature Methods年度技术以来， “空间转录组”迅速成为学术爆款，为很多科研人所青睐。此后，该技术更是屡获殊荣，相关文章发表数量亦呈爆发式增长。那么，该技术到底有着怎样的魅力，让无数科研工作者为之着迷呢？
图1 空间组学技术获奖和文章发表统计
下面，我们就以当前应用最广泛的10x Genomics Visium为例，从技术概况，核心原理&实验流程、数据分析策略、应用领域及案例、样本准备及运输注意事项等方面，为您详细介绍和解析空间转录组技术。
技术概况
空间转录组技术是什么？
空间转录组，顾名思义，是一种能够获取组织空间信息和转录组数据的技术。相比单细胞测序，空间转录组技术弥补了单细胞测序技术在组织解离过程中丢失的空间位置信息——这对于很多生物学过程都至关重要。
对此，艾伦脑科学研究所（Allen Institute for Brain Science）所长Hongkui Zeng在接受Nature Methods采访时做了一个形象的比喻，他表示：处理单个细胞更像是在研究水果沙拉而不是冰沙。现在，通过空间解析转录组学方法，科学家可以获得转录组数据并了解这些细胞在组织中的空间位置。与Zeng共同接受采访的艾伦研究所研究员 Bosiljka Tasic 则进一步补充到：“水果馅饼才是空间转录组学，你确切地知道每块水果的位置以及各水果之间的关系。”
图2 Bulk vs Single-cell vs Spatial
核心原理&实验流程
空间转录组技术是怎么获取基因表达及其空间位置信息的？
空间转录组技术的核心在于如何获取组织中不同空间位置的信息。基于此，空间转录组技术可大致分为基于显微切割、原位杂交（ISH）、原位测序（ISS）和微阵列技术等类型。这些方法各有其优劣势，并寻求实现全转录组、高分辨率和高基因检测效率的平衡，10x Genomics Visium正是它们中的佼佼者。该技术源于2016年瑞典皇家理工学院Joakim Lundeberg在Science上发表的研究——利用基因芯片技术将位置信息保留在芯片上，再利用二代测序技术对组织中RNA进行测序，从而生成组织切片上完整的基因表达图像。2018年底，10X Genomics宣布收购Spatial Transcriptomics，并于2019年11月发布Visium空间基因表达解决方案。
具体而言，10x Genomics Visium空间转录组测序实验主要包括样本制备、文库构建和测序三大部分。其中最为关键和巧妙的是其捕获芯片的构造。空间转录组捕获芯片是由4个6.5X6.5 mm²捕获点阵组成，每个点阵含有约5000个捕获点，每个捕获点的直径为55μm，点与点之间间隔为45μm。因此，平均每个捕获点会捕获到5-10个细胞。进一步地，每个捕获点上都有数百万条探针，探针包括四个部分，其中Partial Read 1是测序时所需要的引物序列，Spatial barcodes的作用是为了标记空间位置信息，UMI是为了定量mRNA，Poly(dT)是用于捕获mRNA。当贴在芯片上的组织切片经过透化后，这些探针可以捕获被释放的mRNA，然后进行后续的文库构建和测序。由于每个点上的Spatial barcodes序列不同，在数据分析时，组织切片上不同的mRNA就可以通过Spatial barcodes加以区分并进行空间定位，从而最终完成基因表达的空间定位。
图3空间转录组实验流程
图4 10x Genomics Visium捕获芯片的结构
数据分析策略
如何分析空间转录组数据
由于空间转录组数据包含多个层次的信息，因此需要根据组织学经验和生物信息学工具&算法一起进行分析。很多研究者的组织学经验都极为丰富，而生物信息学经验则相对缺乏。在这一点上，百奥智汇可以很好地弥补。
与单细胞转录组数据类似，空间转录组数据的分析也是要经过质控、去批次、降维聚类、差异表达等基本分析，然后进行富集分析、共表达分析、相互作用分析、去卷积分析等深度分析。这些分析方法的基本原理与单细胞转录组数据分析类似，但不同的是，10x Genomics Visium空间转录组数据的结果基于Spot中5-10个细胞的基因表达进行（在当前分辨率下）。因此，其结果具有一定的模糊性，仍需要其它技术进行补充（如单细胞转录组测序）。
目前，百奥智汇已建立标准化的空间转录组数据分析流程，可使用多种方法（Seurat V4、SpaGCN、BayeSpace等）对空间转录组数据对样本进行分群聚类，以及基因共表达与空间位置分析、空间亚群间&组间差异表达分析、富集分析、空间细胞相互作用等。此外，结合单细胞转录组数据，百奥智汇还能够对空间转录组数据进行去卷积分析，常用方法包括Giotto、RCTD、MIA、SPOTlight、Cell2location等。此外，百奥智汇还会定期更新和测试最新算法，比较各个算法在不同领域空间数据中的适用性，以帮助合作伙伴更好地将新算法应用于自身领域。
图5空间转录组数据的组成——组织学+生物信息学数据
图6空间转录组+单细胞测序数据整合分析策略
应用领域
发育、神经、肿瘤等
目前，空间转录组技术已被广泛应用于各个领域，根据10x Genomics官网上公布的发表数据可以看到，该技术涵盖了发育、神经、肿瘤等领域，涉及到大脑、肿瘤、胚胎、肝、皮肤等各种组织。同时，该技术除了可以应用在人和小鼠上以外，还可以应用在植物、果蝇等生物上。
空间转录组研究的共性及重要前提是，测定区域已经有明确或经验证的组织学区域划分（如脑、心脏等），或者易于自行设计区域划分和病理状态评估（如癌症、其他疾病病灶等）。此外，该技术通常会与其他组学的技术联合应用，以从多个角度对科学问题进行解释。例如，空间转录组学通常与单细胞数据联合应用，以验证或揭示空间位置上的相互作用机制或发育轨迹。
应用实例1：皮肤癌
上皮细胞癌占人类恶性肿瘤的90%左右。皮肤鳞状细胞癌作为其中典型的一种，尽管可以通过切除治愈，但仍有高达4%的患者会发生淋巴结转移，1.5%的患者死亡。精确刻画肿瘤微环境将有助于探索肿瘤发生发展及治疗的机制。为此，斯坦福大学医学院的研究团队通过单细胞测序技术与空间转录组测序技术相结合，研究了人鳞状细胞癌（cSCC）的空间结构，一篇题为“Multimodal Analysis of Composition and Spatial Architecture in Human Squamous Cell Carcinoma”的研究成果于2020年7月发表在《Cell》上。
该研究主要通过单细胞测序技术及空间转录组技术，绘制了cSCC的肿瘤微环境。通过空间转录组数据，研究者确认肿瘤特异性细胞亚群（TSK）位于肿瘤组织的边缘，并且通过与单细胞数据的结合，揭示了TSK参与广泛的自分泌和旁分泌相互作用，从而为cSCC的进一步研究与临床治疗提供了理论依据。
百奥智汇已对该研究进行了详细解读，更多细节请点击：文献解读|空间转录组测序揭示人鳞状细胞癌空间结构
图7 cSCC研究思路图
应用实例2：神经领域
星形胶质细胞对于保护大脑免受毒性代谢物和外周损伤至关重要。在大脑发生感染、急性损伤和慢性神经退行性疾病后，星形胶质细胞会经历炎症转变。这种转变如何受到时间和性别的影响、其在单细胞水平上的异质性以及不同亚状态在大脑中的空间分布情况尚不清楚。
2021年8月19日，纽约大学的Shane A. Liddelow研究团队在《Nature Neuroscience》上发表了题为“Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the mouse brain”的论文，采用单细胞转录组测序（scRNA-seq）技术结合空间转录组技术、小鼠模型等，揭示了小鼠大脑中的神经炎性星形胶质细胞亚型及其空间分布情况，为分析星形胶质细胞异质性提供了强大的资源，为基于星形胶质细胞的大脑研究提供了重要基础。
百奥智汇已对该研究进行了详细解读，更多细节请点击：文献解读 | 空间转录组技术揭示小鼠大脑中的神经炎性星形胶质细胞亚型
图8 空间转录组学突出了冠状脑切片中的经典星形胶质细胞特异性标志物
样本准备及运输注意事项
如何准备一个合格的空间转录组样本？
目前，百奥智汇可承接基于Visium的空间转录组实验和分析，接收多种类型的组织，包括新鲜组织、OCT包埋组织、FFPE组织。由于前期的样本处理对空间转录组实验的成功至关重要，我们总结了一些样本准备流程和运输注意事项，希望能够对大家的实验起到帮助。
新鲜冷冻组织：
01
在金属烧杯中加入三分之二的异戊烷(使得样本足以完全浸入液体中)，然后放入液氮容器中，液氮与异戊烷的液面相平以便使其充分接触预冷。孵育15分钟。
02
将实验室擦拭布卷起来，从组织表面吸收多余的血液或其他液体，以防止冰晶的形成。（注：组织表面的液体一定要擦拭干净）
03
取得的新鲜样品立即用镊子或抹刀放入异戊烷，直到完全浸入液面中。将组织浸泡1分钟或完全冷冻。时间根据组织类型和大小而有所不同。
04
一旦冷冻，将组织转移到一个预冷的WHEATON CryoELITE 低温冷冻瓶中， 并放置在干冰上。
05
冷冻后的样品可在-80℃下长期保存，或干冰运输至百奥智汇。
注意事项：
✦组织不应直接置于液氮中，因为温差可能导致组织表面沸腾，导致鼓泡和不均匀冻结。这可能会造成组织破裂和形态损伤。
✦可用锡箔纸包裹组织放入冷冻瓶，并放入棉花填充瓶子空隙以防止运输过程中的震动造成样本损坏，注意棉花填充适量，不要挤压到样本。
✦为了防止组织样本的蒸发和脱水，速冻组织样本必须储存在密封的容器中。
OCT包埋组织（包埋方向即为切片方向）：
01
取新鲜组织，用实验室擦拭布从组织表面吸收多余的血液或其他液体，以防止冰晶的形成。（注：组织表面的液体一定要擦拭干净）
02
将新鲜组织置于有盖培养皿中，在室温下用 OCT 小心地将新鲜组织样本覆盖，确认组织表面没有气泡。（注：OCT 使用时避免出现气泡）
03
使用镊子，将覆盖 OCT 的组织放入适当大小的冷冻容器中。标记冷冻模具以标记组织的方向。
04
用额外的 OCT 填充冷冻模具，确保组织被完全覆盖。确认没有气泡，特别是在组织附近。
05
用镊子将含有包埋组织的冷冻模具放入异戊烷中，但不要完全浸入。保持低温与异戊烷接触，直到 OCT 固化变白。如果没有异戊烷和液氮，可以使用干冰粉末或在干冰中冷冻的金属块作为替代。
06
冷冻后，将冰冻好的模具放在干冰上。将冷冻的组织埋入密封容器中，标记好组织方向。在-80℃或液氮下长期保存，或干冰运输至百奥智汇。
注意事项：
✦可以使用 WHEATON CryoELITE 低温冷冻管或可重复密封袋来储存组织块。从冷冻模具中取组织块时，可以用剃须刀片修剪，使其适合冷冻容器。
FFPE组织：
01
由于FFPE样本RNA合格率不高，需要先进行RNA质检：先将组织周围的石蜡去除，每个样本切取4片组织（尽量去除石蜡组织），放置于1.5ml 离心管内，4°C运输送至百奥智汇，由百奥智汇进行RNA提取质检，质检标准为DV200>50%。
02
为了保证正式实验所用切片为感兴趣的研究区域，需要先进行HE染色预实验：可将准备用于HE染色的切片贴在普通载玻片上，然后放置在50ml离心管内，拧紧管盖并用密封袋密封，4°C运输。待RNA质检合格后，进行HE染色。
03
RNA质检和HE染色都确认通过后，即可进行正式实验：将正式样本贴在正式玻片的捕获区域内，42℃干燥3h后，置于50ml离心管内，拧紧管盖，然后将50ml离心管放入装有干燥剂的密封袋里，室温保存过夜，最后室温运输至百奥智汇。
注意事项：
✦可在玻片的反面加入棉花或纱布以固定载玻片位置，防止运输过程中颠簸。
结 语
卡罗林斯卡学院（Karolinska Institute）生物学家 Sten Linnarsson在接受Nature methods采访时说：“一切都与空间有关。”不错的，空间转录组学是单细胞分析之后的下一波浪潮，对于研究人类疾病具有独特优势——人类疾病通常始于单细胞并在空间上传播。随着技术的发展，更高分辨率的空间转录组学和空间多组学技术，必将继续推动生命科学大步向前。
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参考文献：
Method of the Year 2020: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 2021 Jan;18(1):1.
Hasel P, Rose IVL, Sadick JS, Kim RD, Liddelow SA. Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the mouse brain. Nat Neurosci. 2021 Oct;24(10):1475-1487.
Ji AL, Rubin AJ, Thrane K, et al. Multimodal Analysis of Composition and Spatial Architecture in Human Squamous Cell Carcinoma. Cell. 2020 Jul 23;182(2):497-514.e22.
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