2022年9月1日/ eMedClub News/--干细胞治疗已经成为了现代医疗的新趋势。在新冠疫情之下，干细胞治疗表现出了更加广泛的应用前景。据权威机构数据，目前全球干细胞相关市场规模已超过千亿美元，我国的市场规模接近 1500 亿元人民币。目前，治疗糖尿病、中风、帕金森、渐冻症、硬皮病、囊性纤维化、多发性硬化症等的干细胞药物均已经进入临床研究阶段。
广泛的干细胞新药研发活动推动了干细胞市场的发展，同样也会促进干细胞新药的问世。业内认为，未来 5 年将出现更多的增长机会，预计全球干细胞治疗市场复合增长率超过 20%。在干细胞治疗良好的前景驱动下，越来越多企业加入了这一赛道，并且取得了可喜的成果。但干细胞产品的开发流程复杂，涉及工艺可放大，可重复性以及合法合规等问题，其中如何提高干细胞数量和质量，满足干细胞治疗产品临床应用的实际需求是干细胞产业化所面临的巨大挑战。鉴于此，本文从干细胞工艺流程出发，分析如何生产出数量和质量均满足临床应用需求的干细胞产品。
干细胞生产的工艺流程及痛点
干细胞产品的生产工艺是从供者体内获得组织细胞，直至成品细胞输入到患者体内的一系列操作过程，通常还包括细胞的冻存和复苏，研发者对其中的每一步工艺和操作均需开展研究和验证。applikon
有学者将细胞库建立前的过程归为上游工艺，包括供者细胞采集和早期小规模体外培养; 而从细胞库复苏、大规模生物培养开始，包括细胞培养扩增、微载体分离( 如采用生物反应器工艺) 、纯化、浓缩、配制、细胞清洗、冷冻保存、批签发的生产过程被归为下游工艺。
随着我国科学家对于干细胞科学的不断探索和对生产工艺的不断优化，截止目前，我国共有21款间充质干细胞新药获得临床批件，超过30多款间充质干细胞新药临床试验申请获得受理。但我国干细胞行业由于起步较晚，整个产业链与国外相比仍不够完善，整体上中下游产业链的完备和匹配程度较低，干细胞临床应用需求得不到满足，生产成本过高是干细胞产业化所面临的巨大挑战。
为应对这一挑战，干细胞工艺放大是目前重要的解决方案之一，干细胞培养作为干细胞产品成药的重要组成部分，其在不同规模之间的顺利工艺转移和放大，有助于生产出足量符合临床需求的干细胞产品，加速干细胞企业的临床前开发、产品商业化和市场进入的进度。
干细胞工艺放大的重点
干细胞工艺放大的目标是在保证干细胞产品质量符合临床需求的前提下生产出数量更多的产品，衡量成功放大的标准包括细胞密度、细胞生长速率、细胞活率、产物表达率和糖基化水平等多方面。为了能够成功进行工艺放大，在实际工艺开发过程中，应当充分考虑以下几方面。
质量可控性是基础和前提
干细胞组织来源多样，供者遗传背景复杂，干细胞产品制备过程漫长，需要引入抗生素、生长因子、抗体、胶原酶等多种外来成分，制备过程中可能存在细菌、支原体、病毒等污染的外源因子。此外，干细胞产品制备体外操作过程可能会因干细胞的增殖潜能、分化潜能、生物学效力、组织相容性抗原、端粒酶、核型等发生改变带来引起风险，并且在保存、运输、复苏、配制等其他过程中，细胞制品的存活率、生物学效力等均可能变化。
因此，干细胞工艺放大不仅要注重产品的数量，更要注重产品的质量可控，applikon
pH、CO2和O2的控制
pH作为一个重要的工艺参数及控制参数，往往会直接影响细胞表达产物的质量。pH的控制和调节在整个细胞培养的过程中是一个动态的过程，起始阶段，通常需要平衡一下pH使其达到合适的范围，为细胞培养做准备。在培养过程中，细胞代谢的乳酸和通气中的CO2会使培养液中的pH出现下降，因而需要补充碱液来进行动态调节。
其次，CO2亦是影响干细胞工艺放大的重要因素，但在放大培养过程中，CO2的控制一直是较为麻烦的环节。CO2相在液体中的溶解度比较高，经过一段时间的积累，CO2的浓度会上升。当反应器中单位CO2浓度达到15%-20%时，会对细胞产生毒害作用，因此一般会加入一定量的NaHCO3作为缓冲体系。但当CO2浓度远超过缓冲体系的缓冲能力时，就需要考虑利用通气量、气泡尺寸等多种因素共同控制，从而有效地排除CO2。此外，对于大规模细胞培养而言，细胞需氧量较大，实时的氧输送和检测亦是需要考虑的重要因素之一。applikon
混合效果
混合效果是衡量干细胞放大工艺的重要依据，与混合效果较为相关的两个部分为气体与液体的接触情况以及整体的液体培养环境。为了在工艺放大过程中实现良好的混合效果，对于反应器的整体设计有一定的要求。对于较大体积生物反应器来说，其目的是为了能够实现整体培养环境中的稳定和均一，而小规模培养生物反应器则可以很快达到混匀时间。此外，搅拌方式亦是决定混合效果的重要因素，常用的搅拌方式有上搅拌、下搅拌、有无轴封、斜搅拌、直搅拌等，不管选择哪种方式，最终的目的是在尽可能少的对细胞造成损伤的前提下，最大程度提供有效的搅拌效果。为了能够提升干细胞产品生产过程中的混合效果并且满足药企的不同个性化需求，applikon
单位体积输入功率（P/V）
P/V是影响混合效果和培养体系的传质的重要因素，影响P/V的因素有很多，包括搅拌功率、搅拌桨直径、罐体直径、工作体积、液体密度等。基于P/V对工艺放大的重要性，恒定P/V被许多科学家推荐为工艺放大的准则，同时也是目前应用较为普遍的放大策略。综合细胞剪切力的耐受性不同，常见的P/V范围在10-40 W/m3。
综合上述干细胞工艺放大的重要因素，可以发现干细胞工艺放大是一个非常复杂的过程，需要对pH、CO2、O2、混匀效果等诸多因素进行精细地把控，但现有的许多工艺放大方法往往难以达到这些要求，这就导致目前干细胞产量不高且生产成本过高。其次，现有的生物工艺放大方法一般是基于在整个培养规模范围内保持单个参数恒定,该方法不适用跨度较大的规模放大，并且在放大过程中，活细胞浓度（VCC）、细胞活率、细胞直径和表达量等关键工艺指标（KPI）都可能受到影响。
此外，在工艺放大过程中，无论采取哪种放大方法，选择何种放大策略，都会涉及搅拌速度、通气量等在不同工作体积下的换算，这往往需要耗费开发人员大量的时间和精力，而且放大工艺往往需要将诸多放大策略和准则相结合才能达到较好的放大效果。
结 语
近几年，干细胞已经成为了一个热门研究领域，研究人员发现干细胞疗法在疾病治疗和改善领域有着广阔的应用前景，在很多传统治疗方法无法攻克的疾病面前，干细胞疗法有望给患者带来治疗的希望。目前，在全球范围内，干细胞治疗技术和干细胞产业正在迅速发展，许多国家出台了支持性政策，并且诸多公司的成熟产品已经陆续走向市场，干细胞行业有望迎来黄金时代。不过，我们也要看到，干细胞疗法离真正在实际临床治疗方面还有很长的路要探索，期待真正落地为患者带来切实的希望。
参考资料：
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2.Pharmaceutics.2019Oct;11(11).pii:E552.doi:10.3390/pharmaceutics11110552.
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