发表杂志名称（英文名）：Theranostics
影响因子：12.4
online 时间：2025.01.06
- 研究概述
膀胱癌（BLCA）患者对免疫治疗的反应存在差异，寻找预测免疫治疗疗效的生物标志物和新的联合治疗靶点至关重要。本研究通过多公共数据库数据分析 TBX3 在正常及泛癌组织中的表达模式及其与免疫微环境的相关性，运用多种技术探究其在 BLCA 中的作用。结果发现，TBX3 是与 BLCA 免疫抑制微环境相关的关键因子，高表达 TBX3 的肿瘤细胞增加 TGFβ1 分泌，促进癌相关成纤维细胞（CAFs）浸润，形成免疫抑制微环境，降低 CD8+ T 细胞的杀癌效率。敲低 TBX3 联合抗 PD-1 治疗可增加 CD8+ T 细胞浸润，减少 CAFs。此外，TBX3 表达与免疫治疗耐药相关，可预测免疫治疗疗效。综上，TBX3 促进 BLCA 进展和免疫治疗耐药，靶向 TBX3 有望增强 BLCA 免疫治疗效果。
3. 研究结果
图 1：TBX3 在膀胱癌中高表达，且主要表达于恶性上皮细胞和成纤维细胞：
在湘雅队列和 TCGA-BLCA 队列中，TBX3 在癌组织中的表达均显著高于正常组织（图 1A、1B）。对 109 例 BLCA 癌组织和 73 例癌旁组织进行免疫组化（IHC）分析，60.55% 的 BLCA 组织中 TBX3 呈中、高表达，而癌旁组织中仅 9.56%，差异显著（图 1C、1D）。通过单细胞测序发现，TBX3 主要在恶性上皮细胞和成纤维细胞中表达，该结果在公共 BLCA 单细胞测序队列中也得到验证（图 1E、1F）。泛癌分析表明，TBX3 主要在恶性肿瘤细胞、上皮细胞和成纤维细胞中表达（图 1G）。本图结果表明 TBX3 在膀胱癌组织中高表达且具有特定的细胞表达模式。
图 2：TBX3 与 BLCA 中免疫抑制微环境相关：
在 TCGA-BLCA 和湘雅队列中，TBX3 与癌症免疫循环的大多数步骤呈显著负相关，表明其可能通过抑制癌症免疫循环诱导免疫抑制微环境（图 2A）。利用 ssGSEA 算法计算 28 种免疫细胞的浸润情况，发现 TBX3 与效应记忆 CD4 T 细胞、活化 CD8 T 细胞、效应记忆 CD8 T 细胞和活化树突状细胞的浸润显著负相关，该结果在湘雅队列中得到验证（图 2B、2C）。根据 TCGA-BLCA 队列中 TBX3 的中位表达水平分组，低表达组中 CD8+ T 细胞、自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞、1 型辅助性 T（Th1）细胞和树突状细胞的免疫效应基因表达更高（图 2D）。此外，TBX3 与 T 细胞炎性评分（TIS）呈负相关，且与 TIS 的组成基因和免疫检查点抑制剂（ICI）基因也呈负相关，这些结果在 GSE13507 和 GSE48075 数据集中得到验证（图 2E、2F）。综上所述，TBX3 与 BLCA 的免疫抑制微环境密切相关。
图 3：TBX3 通过促进癌相关成纤维细胞抑制 CD8+ T 细胞浸润：
成功构建过表达 TBX3（OE-TBX3）的人（TCCSUP）细胞、敲低 TBX3（shTBX3）的人（T24）细胞和小鼠（MB49）BLCA 细胞系。将过表达 TBX3 的 MB49 细胞接种小鼠建立皮下 BLCA 模型，结果显示 TBX3 过表达显著促进肿瘤生长，降低小鼠生存率（图 3B - 3E）。对肿瘤组织进行单细胞 RNA 测序，发现 TBX3 过表达降低 T 细胞比例，增加 CAFs 比例；进一步通过流式细胞术分析表明受影响的 T 细胞亚型是 CD8+ T 细胞，且 TBX3 过表达抑制 CD8+ T 细胞上 GZMB 的表达，提示其降低了 CD8+ T 细胞的杀癌效率（图 3F - 3I）。流式细胞术和免疫荧光染色还证实 TBX3 过表达促进 BLCA 肿瘤微环境中 CAFs 的浸润（图 3J - 3L）。总之，TBX3 在体内抑制 CD8+ T 细胞浸润，促进 CAFs 浸润。
图 4：TBX3 促进膀胱癌细胞中 TGFβ1 的表达：
基于 TCGA-BLCA 队列进行 GO 和 KEGG 富集分析，发现高、低 TBX3 表达组之间的差异表达基因主要富集在细胞因子和细胞外基质（ECM）相关途径，在 TCCSUP 和 T24 BLCA 细胞系中也验证了该结果（图 4A - 4D）。单细胞数据进一步证实 TBX3 过表达可抑制免疫激活途径（图 4E）。通过高通量 42 细胞因子膜芯片分析，发现 TBX3 过表达的 BLCA 细胞系 TCCSUP 中多种细胞因子发生显著变化，其中 TGFβ1 改变最为明显（图 4F）。上调 TBX3 可增加 BLCA 细胞中 TGFβ1 的表达，下调则减少其表达（图 4G、4H）。机制研究表明，TBX3 过表达增加 TGFβ1 启动子区域的荧光素酶活性，JASPAR 数据库预测 TBX3 在 TGFβ1 启动子上的结合位点，染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实 TBX3 直接结合 TGFβ1 启动子的结合位点 1，突变该结合位点可降低 TGFβ1 启动子的活性（图 4I - 4N）。由此可见，TBX3 通过结合 TGFβ1 启动子促进其表达。
图 5：肿瘤细胞中高表达的 TBX3 以 TGFβ1 依赖的方式塑造非炎性肿瘤微环境：
将过表达 TBX3 的 BLCA 细胞与 CD8+ T 细胞和成纤维细胞共培养，结果显示共培养显著抑制 CD8+ T 细胞的杀癌效率，而用 TGFβ1 中和抗体阻断 TGFβ1 后，CD8+ T 细胞的杀癌效率显著提高，IFN-γ+ 和 GZMB+ CD8+ T 细胞比例增加（图 5B、5C）。与过表达 TBX3 的 BLCA 细胞共培养的成纤维细胞显示出更高水平的 CAF 标记物，该过程可被 TGFβ1 中和抗体抑制（图 5D）。单细胞 RNA 测序数据验证了 TBX3 促进 CAFs 的作用，TBX3 过表达组的 CAF 评分和标记物显著更高，且 ECM、肿瘤侵袭性、胶原形成和 TGFβ1 相关途径均显著激活（图 5E - 5J）。敲低 TBX3 过表达的 MB49 细胞系中的 TGFβ1 并构建皮下 BLCA 模型，发现敲低 TGFβ1 显著抑制 TBX3 的促癌能力，抑制免疫抑制微环境的形成，增加 CD8+ T 细胞、GZMB+ CD8+ T 细胞比例，减少 CAFs（图 S6）。综上，高表达 TBX3 的肿瘤细胞通过增加 TGFβ1 分泌促进 CAFs 浸润，形成免疫抑制微环境。
图 6：敲低 TBX3 抑制肿瘤发展并增强抗 PD-1 治疗效果：
用敲低 TBX3 或对照的 MB49 细胞系建立皮下 BLCA 模型，并分别用抗 PD-1 或 IgG2a 同型抗体处理。结果显示，单独敲低 TBX3 或抗 PD-1 治疗均显著抑制 BLCA 生长，提高小鼠生存率，而两者联合治疗对肿瘤的抑制作用最为显著，具有协同效应（图 6B - 6E）。联合治疗组中 CD8+ T 细胞和 GZMB+ CD8+ T 细胞浸润最高，CAFs 水平最低（图 6F - 6H）。这表明联合治疗可逆转免疫抑制性肿瘤微环境，增强 BLCA 免疫治疗的疗效。
图 7：TBX3 + 肿瘤细胞与人类 BLCA 中 CD8+ T 细胞浸润和分化呈负相关：
制备包含 50 例 BLCA 样本的组织微阵列（TMA），进行多色染色并利用 TissueFAXS 全景定量平台分析。结果显示，TBX3 低表达的肿瘤表现出炎症表型，有大量 CD8+ T 细胞浸润，肿瘤相关成纤维细胞浸润较少；而 TBX3 高表达的肿瘤细胞表现出非炎症表型，会导致大量 CAFs 积累，抑制 CD8+ T 细胞浸润（图 7A、7B）。与 TBX3+ CD8+ T 细胞（0.02%）和 TBX3+ α-SMA+ CAFs（1.02%）的共表达比例相比，TBX3 主要在 BLCA 细胞中表达（71.28%），与单细胞 RNA 测序结果相似（图 7C、7D）。进一步的空间分析表明，随着与 TBX3+ CK19 + 细胞距离的增加，CD8+ T 细胞数量逐渐增加，CAFs 数量逐渐减少（图 7D、7E）。该结果证实了 TBX3 与效应 T 细胞在空间上的排斥关系，这可能是免疫治疗耐药的原因。
图 8：TBX3 表达与免疫检查点阻断（ICB）反应的关系：
在湘雅免疫队列中，高 TBX3 表达的患者对免疫治疗耐药，低 TBX3 表达的患者对治疗敏感，差异具有统计学意义，且高表达 TBX3 的患者无病生存率更差（图 8A - 8F）。在 IMvigor210 队列中，TBX3 在具有沙漠免疫表型、肿瘤细胞上低 PD-L1 表达（TC0）和免疫细胞上低 PD-L1 表达（IC0）的患者中表达显著更高，且在沙漠免疫表型中，低 TBX3 表达与完全缓解（CR）相关（图 8G - 8J）。在 GSE135222、GSE173839 和 PMID26359337 队列中也观察到 TBX3 与免疫治疗耐药相关（图 8K - 8M）。综上所述，TBX3 与多个真实世界队列中的免疫治疗耐药相关。
4. 研究总结
膀胱癌（BLCA）严重威胁人类健康，免疫治疗虽有进展，但仍面临诸多挑战，寻找有效生物标志物和治疗靶点至关重要。本研究通过多种分析方法，发现 TBX3 在 BLCA 免疫抑制微环境中起关键作用。TBX3 主要在恶性上皮细胞和成纤维细胞中高表达，与免疫抑制微环境密切相关。它可促进 TGFβ1 表达，进而增加癌相关成纤维细胞（CAFs）浸润，抑制 CD8+ T 细胞的浸润和杀癌效率，导致免疫治疗耐药。体内实验表明，敲低 TBX3 联合抗 PD-1 治疗能显著抑制肿瘤生长，增强免疫治疗效果。此外，TBX3 表达与多种免疫治疗耐药相关，且与 BLCA 分子亚型有关，低表达 TBX3 的患者对多种治疗更敏感。不过，研究存在局限性，如数据可能有批次效应、TBX3 高表达原因不明等。总体而言，TBX3 可作为 BLCA 免疫治疗的潜在生物标志物和新靶点，为 BLCA 治疗提供了新方向，但还需进一步研究来完善相关理论和治疗策略。
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