3'UTR的作用是什么？(二)

这个是昨天综述的剩余部分

第一个部分可见： 3'UTR的作用是什么？(一)

8. 3'UTR调控蛋白-蛋白相互作用

由于替代的3‘UTR广泛存在，并且3’UTR序列在高等生物的进化过程中已经得到扩展。因此，我们想知道3‘UTR是否能够调节除了蛋白质表达的细胞过程。这一背景下，我们发现，一些蛋白-蛋白相互作用只有在其中一个互动伙伴被3‘UTR招募时才能建立(图1B)。这是SET和CD47之间的PPI的首次显示，然后扩展为人细胞和酵母中的其他质膜蛋白。

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3'UTR通过介导3'UTR依赖性蛋白-蛋白相互作用（PPI）调节蛋白特征。 尽管编码具有相同氨基酸序列的蛋白质，但3'UTR异构体仍可确定蛋白质功能。 这是由3'UTR依赖性PPI引起的，PPI仅由3'UTR长异构体（右图）而不由3'UTR短异构体（左图）介导。 结合3'UTR的RBP以及募集的效应子蛋白均按A进行颜色编码。

CD47膜蛋白是由含有短或长3‘非编码区(SU或LU)的异构体产生的。这些不同的异构体编码的蛋白质具有相同的氨基酸序列，分别称为CD47-SU和CD47-LU。结果发现，只有CD47-LU能够以3‘UTR依赖的方式与蛋白SET相互作用。因此，CD47-SU和CD47-LU存在于不同的蛋白质复合物中，因而可能具有不同的功能。与CD47-LU蛋白的SET结合导致更有效的质膜定位，更好地保护细胞免受巨噬细胞的吞噬，激活Rac1，能够形成片状脂质体，并提高γ照射后的细胞存活率。

3‘UTR能够调节蛋白质复合体的形成和决定蛋白质的功能，表明3’UTR编码的遗传信息可以传递给蛋白质。这种信息传递可以调节没有存在于氨基酸序列中的蛋白质功能。由于3‘UTR内包含的序列长度在高等生物进化过程中有所扩大，3’UTR可能通过提供有关蛋白质的额外信息，包括有关PPI、翻译后Modi UTR阳离子、蛋白质构象和蛋白质多功能的信息，从而导致更高的有机体复杂性。因此，有关蛋白质特征的信息可以在未翻译的mRNA序列中进行遗传编码。目前还没有证明3‘UTR可以调节蛋白质的构象，但这很可能发生，因为依赖于3’UTR的相互作用伙伴与新生肽链的氨基末端的结合可以改变新生蛋白质的折叠。

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3'UTR通过介导3'UTR依赖性PPI调节多种蛋白质特征。 这可能导致3'UTR依赖性蛋白复合物形成，3'UTR依赖性翻译后修饰（P）和3'UTR依赖性蛋白折叠。

虽然尚不清楚这一新的3‘非编码区功能有多广泛，但是似乎3‘UTR介导的PPI是常见的，因为它们也发生在细胞质和核蛋白上。这在由3‘UTR介导的IQGAP1和E3泛素连接酶BIRC3(也称为cIAP2)之间的相互作用中得到了详细的证明。BIRC3蛋白是由不同的3‘UTR异构体产生的。同样，从长3‘UTR亚型产生的BIRC3蛋白称为BIRC3-LU，而由短3’UTR亚型编码的BIRC3蛋白称为BIRC3-SU。长的BIRC3的3‘UTR促进了由BIRC3-LU、IQGAP1和RasGTPase Rala组成的蛋白质复合物的组装，而BIRC3-SU不能形成这种信号复合体。3‘端非编码区依赖的信号复合体与G蛋白偶联受体CXCR4结合，通过配体结合后受体再循环的调控影响CXCR4的质膜表达。由于它被证明是CXCR4介导的B细胞迁移所必需的。所以3‘UTR依赖的信号复合体对CXCR4的募集也有生物学影响。另外，尽管在正常和恶性B细胞中观察到相似的总体BIRC3 mRNA水平，但BIRC3-LU在恶性B细胞中相对BIRC3-SU上调。这种上调被认为促进了白血病细胞在体内的存活，因为依赖于CXCR4的B细胞迁移允许白血病细胞聚集在可以提供生存和增殖的骨髓上(bone marrow niches)。

最后，涉及E3泛素连接酶BIRC3-LU的3'UTR介导的蛋白质复合物的形成具有额外的功能，因为它控制了酶的底物特异性。 RALA的翻译后修饰只能通过BIRC3-LU来完成，而不能通过BIRC3-SU来完成，因此底物修饰需要事先进行蛋白质相互作用。

9. 效应蛋白从3'UTR向蛋白的转移机理

关于超出氨基酸序列的蛋白质特征的遗传信息是如何从mRNAs传递到蛋白质的，目前还很大程度上还不清楚。但是从最近发现了在CD47LU和SET蛋白之间建立3‘UTR介导的相互作用来看。这一过程需要两个与富AU元素结合的RNA绑定蛋白：HUR和TIS11B。已发现此过程需要两个与富含AU的元素结合的RBP HuR和TIS11B。 HuR的功能是招募SET，而TIS11B则创造了一个允许3'UTR介导的SET与CD47和其他膜蛋白结合的环境。TIS11B形成RNA颗粒，可丰富含有富AU元件的膜蛋白编码mRNA。 TIS11B颗粒形成网状网，与内质网交织在一起。TIS11B颗粒和内质网之间的功能相互作用形成了一个亚细胞隔室，具有与细胞质不同的生物物理和生化环境。只有在这个特殊的隔室内才能形成不能在外面建立的特殊的蛋白相互作用。这个隔室使3‘UTR介导的SET与CD47-LU以及其他膜蛋白相互作用。此外，这些研究表明，由于因为它们调节功能相关的3‘UTR介导的PPI的形成。富AU元件除了控制蛋白质丰度之外，还有其他作用。

10. 3'UTR顺式元素通常重复出现，并且经常协同作用

3‘UTR顺式元件有几个共同特征。通常，一个motif只需要3-8nt就可以结合RBP。这样的短基序经常在给定的mRNA中多次出现，并可以协同甚至合作的方式发挥作用。

顺式元件的确定对于鉴定绑定和介导特定3'UTR功能RNA绑定蛋白是很重要的。一般来说，顺式元件是使用缺失结构来进行确定的。然而，通常情况下，整个3‘UTR的表型效应不能用3’UTR的分离部分来概括。例如：Oskar mRNA的翻译调节元件和HMGA2 3‘UTR中的抑制元件上。为了鉴定2800个核苷酸长的HMGA2 3‘UTR中能够完全概括对蛋白质编码的抑制作用的元件，我们测试了一大组3’UTR片段，但没有一个片段具有全部活性。最后发现，3个3‘UTR亚区的协同作用是充分抑制功能所必需的。

除了富AU的元素外，许多其他的顺式调控motif也是已知的，包括那些被IGF2BP1，Pumilio，PTB和MBNL结合的motif。 但是，富AU元件是发现的第一个顺式元素，仍然是研究最广泛的元素。

11. 与细胞系相比，原代细胞对3'UTR异构体表达的调控更大

由于3'UTR异构体比率会受到信号通路的持续性影响。因此，当原代细胞或组织与细胞系比较时，原代细胞在3'UTR异构体的表达上表现出明显更大的变化也就不足为奇了。除了改变的数量，在原代细胞中改变的幅度更高。在内含子中也可以发生选择性切割和多腺苷基化，并且内含子多腺苷酸信号的识别在原代细胞中比在细胞系中发生得更频繁。因此，原代细胞有利于促进的选择性切割和多聚腺苷酸的形成。

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由于3'UTR异构体的细胞样本的天然的特异性，所以在进行分析之前将细胞先进行分选然后再定量的方法比在复杂的组织样本中进行定量更好。 如果不能选择细胞分选，那么最近开发了cTagPAPERCLIP来测量完整组织中特定细胞类型的3'UTR亚型表达是一个很好的方法。这种方法基于与绿色荧光蛋白（GFP）标记的poly（A）结合蛋白（PABP）相关的mRNA 3'末端的co-IP实验，该方法要求小鼠以组织特异性的方式表达标记的PABP。

细胞系和原代细胞之间的代谢差异不仅会导致3'UTR亚型的差异，还会改变miRNA和富AU的元素的调节作用。为了使miRNA抑制靶mRNA的表达，需要将它们装载到一个兆达尔顿大小(megadalton-sized)的复合物中，称为RISC（RNA诱导的沉默复合物）。在细胞系和增殖细胞中，大多数miRNA存在于这些大型复合物中。但是，在原代细胞中，大多数miRNAs与RISC的一个组件Argonaute结合，Argonaute属于RISC的一部分但不是主要的一部分。主要的RISC复合体的组装是由信号转导途径（包括PI3K途径）的激活介导的。因此，在原代细胞中，miRNA仅在途径激活后才能够抑制其靶标（La Rocca等人，2015）。该原理可能对RBP的功能适用，因为信号传导途径可能影响蛋白质复合物的形成。

12. 3'UTR介导的体内调控

3‘UTR对整个生物体基因表达的强大作用已经在小鼠模型中得到了最好的证明。的第一个例子是c-fos转基因小鼠。当含有内源性3‘UTR和多聚腺苷酸信号的c-fos cDNA在强启动子中表达时，未检测到mRNA的表达。然而，在用逆转录病毒长末端重复序列取代3‘UTR后，在整个组织中观察到高mRNA表达。因此，c-fos 3‘UTR是体内抑制c-fos蛋白产生所必需的。

在许多其他小鼠模型中，采用了该原理，因为基因是从其内源性启动子表达的，但是其3'UTR和聚腺苷酸化信号却被强的聚腺苷酸化信号取代。尽管可以在这些小鼠中评估3'UTR对表型的影响，但研究人员需要意识到，所产生的表型是通过3'UTR 顺式反应元件的缺失和通过更有效的mRNA加工而导致的蛋白质而表达而产生的。编码Camk2a蛋白激酶的基因产生一个短的和长的3‘UTR亚型。用单一的强多聚腺苷酸信号替代这两种异构体可以阻止Camk2a mRNA定位于海马神经元的树突。这损害了长期记忆的形成，因为树突状mRNA的定位和局部蛋白质的产生是记忆巩固所必需的。神经营养因子BDNF也是由具有短或长3‘UTR异构体的mRNA编码的。BDNF在海马神经元中表达，完全破坏长3‘UTR亚型导致记忆形成受损。BDNF也在下丘脑神经元中表达，这些细胞中长3‘UTR亚型的破坏导致了严重的肥胖和神经元中BDNF的完全敲除。

另外生长因子、神经营养因子和酶的3‘UTR功能已经在小鼠中进行了研究，其中就包括转化生长因子β1、胶质细胞源性神经营养因子和醛固酮合成酶。研究的表型范围从器官异常、血压升高到胚胎死亡不等。这些实验表明，使用不同的3‘UTR可以使特定的蛋白水平改变100倍，这使得生成具有渐变mRNA表达水平（正常水平的10％至900％）的小鼠成为可能。如果完整的基因敲除导致胚胎致死的话，那这个方法就这特别有用了。

13. CRISPR技术为研究细胞系和生物体中的3'UTR异构体特异性功能提供了便利

从小鼠的3'UTR研究中，我们获悉，保持内源性启动子和聚腺苷酸化信号的调控应是研究重点。 此外，尽管到目前为止，尽管迄今为止主要使用标记的3‘UTR异构体过表达构建体来研究3’UTR异构体的功能。然而CRISPR技术使得在内源性位点对细胞系和动物模型中的3‘UTR亚型进行更复杂的操作成为可能。

在下面的段落和图3中，显示了使用CRISPR技术研究3‘UTR功能的实验方法。如果一个基因产生替代的3‘UTR，并且只对长3’UTR亚型的功能感兴趣，那么图3A中所示的策略是有用的。在实验装置中，比较了以下细胞系或小鼠：(1)野生型，(2)CRISPR介导的蛋白质通过在编码区增加移帧而中断，(3)针对长3‘UTR异构体的短发夹状RNA(ShRNA)的稳定表达，以及(4)对照shRNA的稳定表达。这种方法被用来研究CD47-LU和BIRC3-LU的功能，如果长3‘UTR亚型在低水平表达最合适，因为它的敲除不会对总体蛋白质水平产生太大变化。

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然而，如果长3‘UTR异构体在一定程度表达，并且需要保留总体蛋白表达水平，则可以使用图3B所示的Modified策略。将(1)野生型和(2)蛋白敲除产生的表型与仅表达(3)短或(4)长3‘UTR亚型的细胞系或动物进行比较。为了获得仅表达短3‘UTR异构体的细胞，使用一对引导RNA(guide RNAs)来删除近端和远端多聚腺苷酸信号之间的序列。这使远端多聚腺苷酸信号接近近端多聚腺苷酸信号，并在mRNA处理保持完好的情况下保持整体蛋白表达。为了获得只表达长3‘UTR异构体的细胞，近端的多聚腺苷酸位点可以被删除(使用一对引导RNA)或被点突变(point mutations)破坏。由于 3‘UTR缺失也会影响位于基因3’端的DNA调控元件，在实验中包括包含编码区和短或长3‘UTR异构体的带标签的cDNA构建物是有用的。这些结构的表达将使观察到的表型得以挽救，并确保表型确实是由3‘UTR引起的，而不是由DNA调控元件的缺失引起的。

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为了研究具有单一3‘UTR异构体的基因的3’UTR的调节作用，可以将野生型和蛋白质敲除与CRISPR介导的3‘UTR缺失的细胞系或动物进行比较(图3C)。在这种情况下，使用一对引导RNA来删除终止密码子和多聚腺苷酸信号之间的3‘UTR序列。然而，位于聚腺苷酸信号上游的mRNA100核苷酸序列应该被保留，以便能够从内源性聚腺苷酸信号中进行适当的∼处理。

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通过转染反义吗啉来改变mRNA的加工也可以改变3‘UTR亚型的表达。现在这个方法已经用于可变剪切当中可变外显子的纳入和排除。同样类似的，可变的多聚腺苷酸位点可以用来修饰改变替代的3‘UTR异构体比率。