杂志：2025年5月《Cell Genomics》 影响因子 9
题目：T细胞单细胞 meta 分析揭示免疫检查点疗法反应的克隆动态
单位： 以色列理工学院 （ Technion - Israel Institute of Technology）
很多单细胞的文章上来就是一通分析，给出很多描述性但非结论性的信息，真正有价值的结论倒是很少。最近会大量的读一些单细胞的文章，希望能取其精华去其糟粕，获得一些对制药工业有帮助的信息。
1 亮点
1、扩增的 CD8+ T 细胞特征可以区分 ICI 应答者与非应答者
2、持续存在的 CD8+ T 细胞克隆表现出治疗诱导的转录变化
3、 新生 CD8+ T 细胞克隆的 Pseudo-temporal 状态与应答者相关
4、在非应答者中，肿瘤内与血液共享的 CD8+ T 细胞克隆丰富
2 Summary
1、T 细胞特征与免疫检查点抑制剂治疗后的临床结果关联并不清楚。文章分析了跨越 6 大癌种 460 个样本中 767,606 个配对的 T cell scRNA/TCR-seq 结果
2、文章发现基于扩增的 CD8+ T 细胞信号，可以区分应答者和非应答者。对持续型克隆的分析显示，在不同应答者中，治疗诱导的转录变化存在差异，这表明应答者的恢复能力有所提高。此外，基因轨迹分析揭示了临床相关的新生克隆 Pseudo-temporal 状态的变化。文章发现肿瘤和血液之间共享的克隆在无应答患者中更为丰富，并且执行不同的转录程序
3、研究结果突出了与患者应答相关的克隆转录状态的差异，为阐明有效抗肿瘤免疫的驱动机制提供了支持
3 Introduction
1、ICI 治疗后，T 细胞驱动其抗肿瘤活性的机制目前存在争论，主要有两种假说：（1）从血液中募集新的克隆到肿瘤中（称为“T细胞克隆置换”）；（2）重新激活预先存在的肿瘤内 T 细胞（称为“T 细胞克隆复兴”）
2、要确定一个在不同研究且涵盖多个癌症类型的中均稳定的 ICI 反应特征非常具有挑战性。整合和利用多项研的大量现有 scRNA/TCR-seq 数据进行分析，可以提供有价值的信息
3、文章对来自 12 项单细胞研究中的 163 名接收 ICI 治疗的 6 种癌症类型的配对 scRNA/TCR-seq 数据进行了全面的 meta 分析。文章使用的数据集可以通过 Single-cell Vault 进行访问
4 结果
4.1 分析接受 ICI 治疗患者的肿瘤和血液样本中克隆扩增的 T 细胞
1、文章分析了 12 个公开可用的配对 scRNA/TCR-seq 数据集，包括 370 个肿瘤样本和 90 个血液样本，这些样本来自 163 名接收 ICI 治疗的癌症患者，涵盖 6 种癌症类型，如图 Fig1A,B
2、767,606 个细胞通过了两种数据模式 scRNA-seq 和 scTCR-seq 分别进行了 QC , 并进行进一步的分析。所有数据集之间共享的 12,407 个基因通过了 QC 流程，并用于进一步整合所有数据集，同时解决样本之间的批次效应。详细的数据分析见方法部分
3、血液和肿瘤样本中扩增的 T 细胞主要是 CD8+ ， 如图 Fig1C,E。细胞毒性和T细胞活化标志物（NKG7、PRF1、GNLY和GZMA/B/H/K/M）、耗竭标志物（LAG3、TIGIT 和 PDCD1）以及主要组织相容性复合体（MHC）II类基因（HLA-DRB1/DPA1/DPB1/DRA/DQA1 / DRB5）的表达增加
补充知识：T 细胞耗竭是一种功能失调状态，主要发生在 T 细胞长时间暴露于抗原刺激下（如慢性感染、肿瘤等），以下是常用的耗竭标志物：
4、未扩增的 T 细胞显示幼稚记忆标志物（TCF7、IL7R、CCR7、SELL和LEF1）以及免疫调节标志物（如 FOXP3 ）的表达增加。与血液样本不同，与未扩增的 T 细胞相比，肿瘤样本中扩增的 T 细胞表现出 CXCL13 等基因表达增加
5、使用 Leiden 算法对肿瘤和血液样本的单细胞进行了无监督分类分析，分别得到了 14 个和 9 个 T 细胞簇。对各个簇的特征进行了描述
6、分析揭示了肿瘤和血液样本中扩增的T细胞克隆内基因表达的不同模式。虽然扩增的T细胞具有共同的激活和细胞毒性特征，但在比较对免疫疗法有反应和无反应患者的克隆时，这种特征存在显著差异，这突显了可能导致差异化治疗结果的不同分子通路
4.2 稳定的扩增特征可以区分 ICI 相应者和非相应者
1、对反应者和无反应者之间扩增的 CD8+克隆的单细胞进行了差异表达分析，最终获得了 6 个在响应者的扩增克隆中高度表达的标记特征。对这些标记基因和相关的功能进行了描述
2、找证据支持，分析数据，验证了扩增相关反应标记物特征能够稳健地区分来自多项研究和不同癌症类型的有反应和无反应患者
4.3 扩增的CD8+克隆的Pseudo-temporal 变化与临床结果的关系
1、以拟批量方式分析了每个样本的扩增克隆，并使用每个扩增克隆中所有单细胞的平均表达量，进行 GeneTrajectory 分析。扩增的CD8+克隆的轨迹表明克隆从幼稚记忆状态（CCR7、IL7R和TCF7）向激活（GZMK）、克隆耗竭（CTLA4、PDCD1和HAVCR2）转变，并最终达到CXCL13表达和细胞周期状态（TYMS、TK1、MKI67和DHFR），见 Fig4B
2、基因轨迹又和代谢进行了关联，描述了一些信息
补充知识：Pseudo-temporal 分析
4.4 与血液共享的肿瘤内 CD8+克隆与无应答者有关
1、利用三个数据集检测了肿瘤和匹配血液样本中共有扩增克隆之间的关系。总体而言，在20例对免疫疗法无反应的患者和10例对免疫疗法有反应的患者中，15例无反应的患者（75%）和4例对免疫疗法有反应的患者（40%）中的大多数都拥有两种组织类型共有的扩增CD8 +克隆
2、无应答者从血液中募集克隆的能力更强，而应答者则表现出更高的肿瘤内再激活率。文章的结果突显了应答患者和无应答患者分别通过局部扩增或外周募集来重新激活或募集其肿瘤内扩增克隆的潜在机制
5 方法
5.1 所用到的数据集和分析软件
文章并未涉及任何新的实验模型、受试者，使用的所有数据均已公开，在下面表中。根据质量控制，从每个数据集获得的样本和单细胞在 Table S1 中进行了描述
Table S1:Tumor Samples
Table S1:Blood Samples
Table S1:Additional Tumor Samples
5.2 配对 scRNA/TCRseq 数据集和预处理
1、所有的 scRNAseq 数据集都是 droplet-based，含有唯一的 UMI 标签。对于每个数据集，采用 Tang 文章 和 Scanpy 工具进行预处理：删除表达少于 200 个基因的细胞，删除在少于 3 个细胞中表达的基因，删除线粒体基因数超过 10% 的细胞。使用Scrublet 去除双联体细胞（doublet_score >0.3）
2、对于 scTCRseq 数据集，文章重新整理了每个数据集，使用 Scirpy 进行进一步处理，使用 “scirpy.io.read_10x_vdj” 函数直接上传
这里补充一个为什么要做配对 scRNA/TCRseq 的信息：
5.3 scRNA/TCRseq 数据集的整合
1、最终共计获得来自肿瘤样本的 683,709 个单细胞和来自血液样本的 83,897 个单细胞，所有单细胞均包含配对的 scRNA/TCRseq 数据。所有数据集共包含 12,407 个基因，肿瘤和血液样本可以进行分别分析
2、对于整合的 scRNAseq 数据集，进行表达量标准化。为了保留本研究中分析的不同癌症类型之间的生物学差异，我们使用“scanpy.pp.highly_variable_genes”工具计算高变异基因，并将“batch_key”设置为“cancer type”。之后，计算了一个40成分的主成分分析 (PCA)，并应用了批量平衡K最近邻 (BBKNN)，并将“ batch_key”设置为“sample”，以消除样本间的批次效应。使用 UMAP 进行降维和数据可视化
5.4 基于马尔可夫亲和性的细胞图插补（MAGIC）用于检测 drop-outs 并标记 expanded clones
1、根据 CD8A/B和CD4估算基因表达并进行 T 细胞亚型的分类：当CD8A或CD8B的估算或非估算基因表达高于阈值时，认为单个细胞为 CD8+ ；类似地，当 CD4 的估算或非估算基因表达高于阈值时，单个细胞被认为是 CD4+；双阳性细胞定义为同时为 CD8+ 和 CD4+ 的细胞。双阴性细胞是指同时为 CD8- 和 CD4- 的细胞
2、使用 “scirpy.tl.define_clonotypes” 根据每个细胞的 CDR3 核酸序列的身份定义克隆类型，使得 VJ 和 VDJ CDR3 序列必须匹配，并且每个克隆中所有细胞的 T 细胞亚型相同
3、clones 和 expanded clones 的定义如下：
Imputed 补全的定义：
5.5 聚类和差异基因表达分析
使用 Scanpy 实现基于 Leiden 算法的无监督聚类。带有 Wilcoxon 秩和检验的“scanpy.tl.rank_genes_groups”函数计算每个簇的差异表达基因 (DEG)
5.6 Extraction of CD8+ T cells from expanded clones that do not target known non-cancerous antigens
1、由于每个样本扩增的 CD8+ 克隆的丰度显著高于所有其他克隆类型，后续整个下游分析中仅关注 CD8+ T 细胞
2、对每个细胞分配的 VDJdb 注释，只考虑不靶向已知非癌性抗原的克隆
5.6 通过反应分析扩增的 CD8+ T 细胞中上调的基因
GSEApy 富集模块用于分析应答者和无应答者中过表达的基因。使用分子特征数据库 (MSigDB) 定义的“MSigDB_Hallmark_2020” 基因集，代表 50 个定义明确的生物学过程
5.7 检测稳定的扩增响应特征
为了识别扩增的 CD8+ T 细胞的应答特征，并在各个数据集中具有重复性。对 9 个数据集的应答者和无应答者的扩增的 CD8+ T 细胞进行了差异表达分析，使用了 Scanpy 的“scanpy.tl.rank_genes_groups”函数
5.8 在其他配对 scRNA/TCRseq 数据集上验证扩增响应特征
使用 Bassez 等人的两组接受 ICI 治疗的乳腺癌患者验证了设计的应答特征
5.9 测试CXCL13作为单一生物标志物的预测能力
对于每个样本，文章统计了扩增的 CD8+ T 细胞中表达 CXCL13 的比例，也在应答者和无应答者之间比较了这一比例
5.10 定义用于识别代谢 cNMF 程序的代谢基因集
使用一组基于 Recon 2 代谢重建的代谢基因和途径
5.11 克隆 pseudobulk 分析
基于每个样本中同一克隆的所有单细胞的基因平均表达，以拟批量方式分析了每个扩增的CD8 + 克隆。单细胞数据虽然细致，但 每个细胞的表达非常稀疏（dropout 高）如果把同一个克隆的细胞聚在一起，合并其表达数据，就能：提高信噪比，反映一个克隆整体的功能状态，做“每个克隆为一个样本”的差异分析
5.12 克隆基因轨迹分析
使用 GeneTrajectory 进行基因轨迹分析，利用 “gene_trajectory.get_graph_distance”函数，kNN 取值“k = 20”，并遵循作者提供的标准方案，为所分析的扩增 CD8 + 克隆获得了单一基因轨迹
5.13 克隆衰竭、记忆和代谢评分
使用了 Scanpy 的函数“scanpy.tl.score_genes”及其默认参数来确定每个克隆的分数
6 参考文献
[1] Ofir Shorer, Asaf Pinhasi, Keren Yizhak,Single-cell meta-analysis of T cells reveals clonal dynamics of response to checkpoint immunotherapy,
Cell Genomics,Volume 5, Issue 5,2025
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