Defective interfering RNA对真菌病毒Partitivirus在寄主Rosellinia necatrix中的复制和诱导症状的影响
论文摘要
一个新的真菌病毒，命名为Rosellinia necatrixpartitivirus 2 (RnPV2)是从真菌Rosellinia necatrix W57菌株中分离出来的。
它3个dsRNA片段（segment），分别是dsRNA1（2.0kbp），dsRNA2（1.8kbp）和defective interfering dsRNA1（DI-dsRNA1, 1.7kbp）。dsRNA2编码衣壳蛋白（CP），而dsRNA1和DI-RNA1可以分别编码完整和缺陷（被截断）的RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）。
人工的将RnPV2导入基因突变的栗疫病菌菌株中（RNA沉默功能缺陷，▲dcl-2），成功获得了被RnPV2侵染且含有DI-dsRNA1以及不含有DI-dsRNA1的菌株（DI-dsRNA1-carrying RnPV2 strain/DI-dsRNA1-free RnPV2 strain）。发现不含有DI-dsRNA1的被感染的真菌，其中病毒的复制和侵染症状相比含有DI的更加严重，基本确定这个DI-dsRNA1的本质是一种DI-RNA。
继续对获得的材料进行了一系列比较，发现两种被病毒侵染的突变▲dcl-2菌株与病毒侵染的野生型栗疫病病原菌EP155相比，突变体中病毒复制和积累水平高；病毒侵染症状明显，说明RNA沉默机制对一直partitivirus是有作用的。
以上实验是在RnPV2的非天然寄主中进行的，在天然寄主W57中的实验结果显示DI对侵染症状影响不明显。
以上结果说明该DI-RNA可以改变partitivirus的侵染症状，但是该作用受寄主真菌类型的影响。
关于DI-RNA
Defective RNA（D-RNA）和defective interfering RNA（DI-RNA）是亚病毒RNAs的存在形式，DI-RNAs会妨碍完整的同源病毒的复制，而D-RNAs一般不会。
DI-RNAs对于病毒复制来说不是必须的，且自身复制需在辅助病毒的帮助下才可以作为复制模板。现在普遍认为DI-RNA是由于RdRp介导的模板切换机制产生的（RdRp-mediated template switch mechanism），它们一般对它们的辅助病毒的症状表达和复制有负面的影响。
目前被广泛接受的解释是它与辅助病毒对于一些作用因子和底物有竞争关系，所以会产生对辅助病毒的干扰；另一个解释是DI-RNAs是病毒的寄主比如植物等的RNA沉默抗病毒机制产生的，所以导致了病毒侵染症状的减轻。有研究表明RNA沉默过程和DI-RNAs的产生有关，它们认为病毒寄主的RNA沉默机制增加了或者提供了产生DI-RNAs的底物。
实验材料
真菌
R. necatrix W57，从中分离得到RnPV2病毒。
R. necatrix W8，作为对照，其中有RnPV1病毒。
R. necatrix W57-T25 ，将W57菌株剔除病毒得到的无毒菌株，用作对照和转化实验受体。
W57-T25-Tf18；W57-T25-Tf19；W57-T25-Tf22；W57-T25-Tf29，是T25受体转化了病毒（RnPV2-DI(-)转化的是不含有DI-dsRNA的病毒）后得到的菌株。
EP155，板栗疫病病原菌标准菌株，无毒型
▲dcl-2 mutantRNA沉默机制缺陷的EP155
C15▲dcl-2 mutant transfectant with RnPV2-DI(+)
C16▲dcl-2 mutant transfectant with RnPV2-DI(-)
文中出现的病毒有：RnPV2-W57（RnPV2-DI(+)）， RnPV2-DI(-)和CHV1-EP713。
关于实验材料制备以及文中用到的病毒粒子纯化、电镜观察、MALDI-TOF MS蛋白分析、真菌与真菌病毒转化、RNA提取和分析，病毒全基因组测序和分子鉴定等实验操作详见论文及其引用文献，我就不赘述了。
实验结论
1. 发现R. nexatrix菌株W57被一种有DI-RNA片段的patitivirus（RnPV2）侵染
这部分结果见下图：
W57和治愈后的W57-T25菌落生长差别不大（1-A）；
病毒粒子为直径31nm的二十面体（1-B）；
SDS-PAGE分析纯化的病毒粒子，发现有一个54-kDa条带（1-C）；
病毒粒子的dsRNA样品凝胶电泳图（1-D）显示有三个条带，命名为dsRNA1，dsRNA2，DI-dsRNA1（说实话，作者眼神真的好，且经验丰富，如果我看到这个胶，肯定觉得是一个条带加些许拖尾）；
测定了片段的序列（1-E），5‘端12nt序列（ 5’-AGAUAAGUUCUU-3‘）和3’端的polyA尾巴，以及三核苷酸UGU在三个片段中都是保守的（图2）。预测1编码RdRp，603aa，70kDa；2编码CP，483aa，54kDa。
对于1-C中分析到的54kDa蛋白质，用MALDI-TOF MS和MS/MS进行了PMF分析，结果明确表明RnPV2主要的结构蛋白是由dsRNA2编码的。
DI-dsRNA1（1,719nt）序列分析表明是dsRNA1的DI-RNA，其RdRp-编码ORF在内部被单个碱基插入（nucleotide insertion）的移码突变（frameshift）打断；而且中间还有266nt的缺失，以及碱基替换（ nucleotide substitutions）。
实验中使用的dsRNA材料是从原始W57菌株三次继代培养的实验室菌株中分离的，所以很可能DI-dsRNA1在田间已经存在，而非实验室后期产生的。
另外，DI-dsRNA1的存在可能导致dsRNA1积累量的降低，对RnPV2的mRNAs进行了Northern blot，结果显示DI-dsRNA1转录本是dsRNA1转录本的12至15倍。
Chiba, S., Lin,Y.-H., Kondo, H., Kanematsu, S., and Suzuki, N. (2013) Effects of defectiveinterfering RNA on symptom induction by, and replication of, a novelpartitivirus from a phytopathogenic fungus, Rosellinia necatrix. Journal of virology 87: 2330-2341.
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