作者：脑袋瓜～嗡
编辑：angelica
随着09年单细胞转录组技术的现世，使得科研精度从组织转变为单个细胞的层面。10XGenomics单细胞转录组技术作为其中目前来说最为大火的技术，对于细胞发育、肿瘤异质性以及细胞图谱等等方面的研究发挥着越来越重要的作用。今天我们一起看下其中可能遇到的问题吧～
Q1. 什么样的原始数据可以直接用于cellranger分析呢？
A1. 使用cellranger软件进行分析，使用的是：
*_S1_L001_R1_001.fastq.gz
*_S1_L001_R2_001.fastq.gz
分析软件只识别形如以下格式的fq文件：
“Sample Name_S1_L00[Lane Number]_[Read Type]_001.fastq.gz
Q2. 通常样品nGene和nUMI的相关性系数要在0.8以上，但是这次实验的相关性在0.5以下，怎么解释这个情况，得到的实验下机数据还可靠吗？
A2. 影响相关性的因素有文库制备过程的稳定性和细胞状态的一致性。如果相关性较低，可能是由于文库中细胞状态差异较大。
可能与细胞检测时的状态有关，有些细胞可能活性降低，核酸存在降解的状态。
Q3. 检测线粒体表达量目的是为了作为阴性对照吗？正常线粒体基因在细胞中含量不是很多，那检测线粒体表达量是评价测序结果好坏的一个阴性对照吗？
A3. 检测线粒体基因的表达量是一个数据分析质控指标。除了部分特殊类型的细胞（如卵细胞）。如果定位到线粒体的比例高，表明细胞质量较低，这可能是细胞凋亡增加所致。
Q4. valid barcodes只有92%，请问其他的reads是不带标记还是带错误标记呢？如果是错误标记，该错误是在哪一步引入的？
A4. 都会有barcode，这个barcode不在白名单里面，可能是错配较多，或者质量较差。
Q5. 能否根据已知的某一个或者某几个的marker基因，过滤出高表达这些maker基因的细胞，然后对这些细胞重新进行聚类分析呢？
A5. 可以。可以直接计算出每个细胞中这些marker基因的表达比例，然后挑选高表达（需要确定高表达的阈值）这些基因的细胞做后续分析。
Q6. 关注的基因表达量水平比较低，分析中采用的归一化方法对低表达量基因的影响是否很大呢？
A6. seurat分析中，默认采用LogNormalize归一化算法。该归一化对低表达的基因没有影响。
Q7. seurat分析里P_val和p_val_adj要考虑么？p_val_adj有数值为1的，应该选取什么样的数值呢？
A7.seurat软件结果只对avg_logFC有个阈值控制（seurat软件默认），一般为0.25。
condition_avg_logFC: average log2 fold change for condition. Positive values indicate that the gene is more highly expressed in the cluster.
对其他值比如P_val和p_val_adj都没有设定阈值，所以会出现有p_val_adj值为1的结果。
主要原因是由于单细胞数据表达量数据较低（与bulk RNA相比较），设定太严格的阈值可能会造成有些有意义的数据被过滤掉了。
P_val和p_val_adj的值可以参考一下，差异倍数相差不大的话，可以考虑一下这两个值。
参考文献
https://www.biorxiv.org/content/biorxiv/early/2019/03/18/576827.full.pdf
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