影响因子：4.6
研究概述：结核分枝杆菌（Mtb）是结核病（TB）的病原体，结核病是传染病死亡的主要原因之一，目前没有一个特征具有符合 WHO 结核病确诊检测标准的敏感性和特异性。当 Mtb 通过气溶胶途径进入肺部时，它主要感染肺泡巨噬细胞。与其他类型的程序性细胞死亡不同，铁死亡是由铁依赖性、压倒性的脂质过氧化引起的，导致细胞膜破裂和细胞死亡。被 Mtb 感染的巨噬细胞发生铁死亡，导致感染播散。单细胞RNA测序（scRNA-seq）允许在单细胞分辨率下进行全基因组基因表达分析，并已用于发现与结核病相关的新细胞类型和生物标志物。由于铁死亡与 TB 发病机制和传播的关联，这项研究以单细胞分辨率分析全免疫细胞中铁死亡相关基因的表达，通过将 scRNA-seq 数据与微阵列和bulk RNA 测序数据相结合，鉴定并评估了铁死亡相关基因特征，以诊断活动性结核病并与抗结核治疗效果相关。
图形摘要如下：
研究结果：
活动性 TB 患者免疫细胞的单细胞转录图谱
对来自 TB 患者和年龄和性别匹配的健康对照者的 64,336 个 PBMC 细胞进行了单细胞转录组分析，根据基因表达谱对细胞进行聚类（图 1A），确定了四种主要细胞类型，包括 T 细胞、NK 细胞、B 细胞和髓样细胞（图 1A）。结核病患者和健康对照者四种细胞类型的相对丰度比较表明，结核病患者的 T 细胞频率较低，髓系细胞比例较高（图 1B）。根据 scRNA-seq 数据的 t-SNE 投影，可以进一步分类 25 种不同的细胞亚型，包括 CD4+ T 细胞（CD4_naive、CD4_CCL5）、CD8+ T 细胞（CD8_naive、CD8_GZMB、CD8_GZMK）、gd T 细胞、SLC4A10+ T 细胞 （SLC4A10_ T）、调节性 T 细胞 （Treg）、PRF1+ T 细胞 （PRF1_T）、NK 细胞（NK、NK_XCL1、NK_NLRC2）、 B 细胞、浆细胞、CD14+ 单核细胞（CD14、CD14_PPIF、CD14_EGR1）、CD16+ 单核细胞（CD16_Mono）、CD16b+ 单核细胞 （CD16b_Mono）、CD14 低单核细胞（CD14_low_Mono）、中性粒细胞、血小板、髓源性抑制细胞（MDSC）、造血干细胞（HSC）和 MKI67+ 细胞（KI67）（图 1C-1F）。
为了进一步了解铁死亡在 Mtb 感染中的作用，从 FerrDb 数据库中获得了564个铁死亡相关基因，通过 Seurat 的 FindAllMarkers 功能筛选了由 TB 患者和健康对照者的 scRNA-seq 数据投射的细胞簇的差异表达细胞标志物鉴定出 1,014 个细胞簇标记基因，取交集得到58 个铁死亡相关基因（图 1G）。为了解单细胞图谱中 58 个铁死亡相关基因的表达谱，通过 AUCell 工具计算AUC，发现铁死亡相关基因表达水平较高的细胞具有较高的 AUC 值。对 AUC 评分较高的 3176 个细胞的进一步分析表明，这些基因集几乎完全在骨髓细胞的细胞簇中表达（图 1I）
铁死亡相关基因与活动性 TB 的相关性
为了研究与活动性结核病相关的基因，作者 分析了 14 名健康对照、14 名潜伏性结核病感染（LTBI）和14名活动性结核病患者的血液样本的基因表达数据集GSE62525，发现在活动性结核病与健康对照组中分别有 445 个基因上调和 659 个基因下调（图 2A 和 2B）。GO富集分析显示，DEGs主要参与与单核细胞分化、淋巴细胞分化、免疫系统过程的负调控和白细胞细胞粘附调节相关的生物过程（图 2C）。结核病患者与 LTBI 组有 843 个 DEGs，包括 440 个上调基因和 403 个下调基因（图 2D 和 2E）。GO 富集分析表明，DEGs 主要参与与对脂多糖的反应、细菌来源的分子、细胞对生物刺激的反应和炎症反应的调节相关的生物过程（图 2F）。
由于 TB 、 LTBI 和健康对照组的 DEGs 主要富集于参与免疫反应的通路，作者进一步研究了免疫相关基因与 TB 疾病状态的关联。从 Immport 和 InnateDB 数据库获得免疫相关基，共识聚类分析表明，GSE62525数据集中的所有样本都可以分为六个聚类（图 2H）。通过使用数据集中的免疫相关基因GSE62525进行 WGCNA 识别出活动性结核病相关的14个关键模块（图 2I-J），黄色（0.83）、蓝色（0.79） 和棕色（0.71）模块与活动性结核病的相关性最高（图 2K）。当模块基因与 58 个铁死亡相关基因相交时，发现 12 个重叠的基因，包括 AKR1C3、RB1、CYBB、NCF2、CTSB、CD44、PPARG、CD82、VDR、ACSL4、TLR4 和 BID，与活动性结核病相关，并用于进一步分析（图 2O）。
铁死亡相关基因的轨迹分析
对12个铁死亡相关基因进行相关性分析（图 3A），并检查12 个铁死亡相关基因在单细胞簇中的表达，发现AKR1C3 在 NK 细胞中主要表达，而 CD44 和 RB1 在大多数细胞簇中表达（图 3B），其他 9 个基因主要在髓系细胞中表达（图 3B）。
从 scRNA-seq 数据中提取了18,793 个髓系细胞并鉴定了10 个细胞簇（图 3C），随后对所有髓系细胞的细胞轨迹分化进行模拟分析，观察到 7 种分化的细胞状态并用不同的颜色标记（图 3D）。如图 3E 顶部的标签所示，随着时间的推移，较深到浅蓝色表现出不同的细胞分化状态。M_HLA_DQA2 和 M_IFI44 细胞簇主要在分化开始时发现，可能分化为 M_SKAP1 细胞和 M_PPARG 细胞（图 3F）。12 个铁死亡相关基因的表达随不同的分化状态而变化 （图 3G）。沿轨迹，CD44、CD82 和 PPARG 的表达水平在转换过程中逐渐升高。在 CTSB、CYBB、RB1 和 TLR4 中可以看到相反的趋势（图 3G）。
通过机器学习算法筛选具有诊断价值的铁死亡相关基因
采用三种机器学习算法 LASSO 、All Subset Regression 和 Stepwise Regression 筛选 12个具有诊断潜力的铁死亡相关基因。LASSO 分析发现，五个基因 （ACSL4、CTSB、PPARG、TLR4 和 VDR）与活动性结核病相关（图 4A 和 4B），Stepwise Regression确定了与活动性结核病相关的6个基因（ACSL4、CD82、CTSB、CYBB、PPARG 和 TLR4），而All Subset Regression发现了 4 个基因（ACSL4、 CTSB、 CYBB和 TLR4）（图 4C）。三种机器学习算法的交集确定了三个基因（ACSL4、CTSB 和 TLR4），它们被指定为铁死亡相关基因特征（图 4D）。
随后作者评估了ACSL4、CTSB 和 TLR4 基因的铁死亡相关基因特征对 TB 的诊断效能。GSE62525、GSE107991、GSE107994 和 GSE39941 四个数据集分别用作测试数据集和验证数据集。在所有四个数据集中，结核病患者 ACSL4、CTSB 和 TLR4 基因的表达水平显著高于 LTBI 和/或健康对照者（图 4E、4G、4I 和 4K）。三者区分 TB 和健康对照的基因特征的 AUC 为 1.000、0.906 和 0.974（图 4F、4H 和 4J），区分 TB 和 LTBI，四个数据集中的 AUC 分别为 1.000、0.866、0.912 和 0.786（图 4F、4H、4J 和 4L）。这些结果表明铁死亡相关特征是区分动性 TB 和 LTBI 的有前途的生物标志物。
铁死亡相关基因特征与 TB 治疗效果的相关性
为了评估铁死亡相关基因特征的预后价值，作者分析了 GSE89403，其中包含 50 名健康对照、142 名治愈的结核病患者和 14 名结核病治疗失败的患者，将样本分为健康对照、治愈和失败 3 组，而治愈根据细菌转化的时间分为 4 组。诊断时失败治疗组的特征基因表达最高（图 5A、5C 和 5E）。在抗结核治疗过程中，在治愈的结核病患者的快速细菌学转化组中，特征基因的表达迅速下降，而在失败患者组中观察到的表达变化要小得多（图 5B、5D 和 5F）。
GSE157657包括 38 名健康对照和 45 名活动性结核病患者，也被用于验证铁死亡相关基因特征的预后价值。将结核病患者进一步分为短期抗结核治疗组 （short-ATT） 组 15 例和长期抗结核治疗组 （long-ATT） 30 例。抗结核治疗不到 200 天治愈的药物敏感结核病患者被视为短 ATT，而需要治疗超过 200 天的患者被归为长 ATT 组。在 long-ATT 组中，三个铁死亡相关特征基因的表达水平在诊断时最高（图 6A、6C 和 6E）。
研究总结
这项研究通过 scRNA-seq 建立了活动性 TB 患者和健康对照者的免疫细胞图谱。通过将 scRNA-seq 数据与微阵列和bulk RNA 测序数据进行整合分析，确定了TB的三基因铁死亡相关特征（ACSL4、CTSB 和 TLR4），随后通过带有治疗反应信息的数据集证明铁死亡相关基因特征与结核病治疗效果相关，是区分活动性结核病和潜伏性结核病感染的有前途的生物标志物。
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