食管癌是世界上最具侵袭性和致死性的恶性肿瘤之一。它主要分为两种亚型：食管鳞状细胞癌（ESCC）和食管腺癌（EAC）。ESCC主要分布在东亚，是中国发生的食管癌症的主要类型。食管鳞状癌前病变（ESPL）被认为是ESCC的潜在前兆，表现为从正常上皮（NE）发展为低级别上皮内瘤变（LGIN）、高级别上皮内瘤变（HGIN），并最终发展为侵袭性癌症。然而，目前缺乏用于ESCC早期诊断的精确指标，因此，迫切需要去找寻食管鳞癌早期诊断的潜在指标，以证明最初诊断为LGIN或HGIN的患者ESCC进展的潜力，为食管鳞癌早期发现预防策略提供重要依据。
为发现食管鳞癌早期诊断的潜在指标，2023年8月郑州大学董子钢和李翔团队在《Nature Communications》（IF：16.6）杂志上发表题为：“Spatial transcriptomics analysis of esophageal squamous precancerous lesions and their progression to esophageal cancer”的研究性论文（图1）。文中使用的DSP空间全转录组技术由非因生物提供，该文章是国内首篇影响因子超过16的DSP文章！
图1
本研究应用数字化空间分析技术（DSP），对19例LGIN，HGIN或ESCC的患者标本进行空间全转录分析，用PanCK、CD45、Syto13分别对上皮细胞、免疫细胞和细胞核进行形态学标记，以绘制食管鳞癌不同进展阶段的组织样本特定区域：NE（正常），LGIN，HGIN和ESCC的空间转录组图谱。研究表明，鳞状上皮热休克蛋白58 (Cornulin，CRNN）和转胶蛋白2 (Transgelin 2, TAGLN2）异常表达与食管癌前病变向食管癌进展相关，并有望成为食管癌早期干预标志物。
研究亮点
目前，关于从 ESPL 到 ESCC 的发病机制的报道很少，主要原因如下：（1）新鲜的 ESPL 组织（通常从活检中获得）的体积不足以支持多组学分析；（2）大部分组织由正常上皮（NE）组成，只有一小部分 ESPL 组织，尤其是癌前病变的早期阶段，代表真正的 ESPL。当使用这些组织进行bulk RNAseq 时，数据可能并不精确。空间转录组学保留了空间位置，为研究细胞功能、表型和微环境之间的关系提供了重要信息。本研究利用数字化空间分析技术（DSP），可以在不受其他组织干扰的情况下选择ESPL的真实区域并进行后续研究。
研究思路
研究结果
1. ESPL的空间全转录组分析
为表征ESPL到ESCC的发病机制，研究团队对19例LGIN（n=6），HGIN（n=6）或ESCC（n=7）的患者标本进行空间全转录组分析（图2）。用PanCK、CD45、Syto13分别对上皮细胞、免疫细胞和细胞核进行形态学标记，以绘制食管鳞癌不同进展阶段的组织样本特定区域：NE（正常），LGIN，HGIN和ESCC的空间转录组图谱。
图2
2. ESPL状态分析
研究癌前病变的状态对于了解ESCC进展的病因和机制至关重要。所以，研究团队重点从肿瘤发生过程中的生物学过程、调控网络、肿瘤中发生的异常代谢途径、肿瘤中异常信号转导途径、免疫相关途径等方面分析ESPL的状态及ESCC分期（图3）。研究数据发现，细胞周期和p53信号通路的富集随着ESCC的进展而增加，几种异常代谢过程在 ESCC 进展期间升高，癌症相关的异常信号转导通路，包括EGFR，FGFR，WNT，TGF-Β和MAPK在ESCC进展阶段被激活。
图3
对ESPL和ESCC样本进行免疫浸润分析，探讨免疫微环境的变化。数据显示，在从ESPL到ESCC的过渡过程中，成纤维细胞和巨噬细胞有所增加。此外，研究团队也观察到在ESPL阶段具有抗癌作用的M1巨噬细胞减少，而具有促癌功能的M2巨噬细胞增加。然后利用免疫荧光染色进行验证，发现从NE到ESCC的各个疾病阶段，α-SMA和CD68的表达水平增加。所以，研究结果表明ESPL阶段的免疫抑制条件，可能减弱抗肿瘤免疫反应并加速ESCC肿瘤发生。
3. ESPL空间定义区域的差异表达基因分析
研究团队对ESPL空间定义区域进行主成分分析（PCA）和DEG分析，结果表明，ESCC高风险的LGIN患者可能需要早期治疗。
图4
为了阐明食管癌发病机制，研究团队在LGIN，HGIN和ESCC组中进行通路富集分析（图5）。数据表明，在LGIN阶段的ESCC肿瘤发生过程中，基因表达和生物学功能开始改变，所以有必要对 ESCC 高风险的 LGIN 患者进行早期干预。
图5
为了全面了解食管上皮细胞状态转变及其与DEG的相关性，研究团队通过伪时间分析来模拟ESCC的发育轨迹。数据表明，食管上皮细胞转变与ESCC发育阶段之间的明显对应关系。在数据中，角化包膜的形成和角化是最显著改变的信号通路，表明它们在ESCC进展过程中起关键作用。因此，研究团队定义了分化和角化(D&K)评分和癌化评分来预测ESCC的预后。
4. 预测ESCC风险的候选指标筛选
为了确定作为ESPL进展为ESCC风险指标的潜在候选基因，研究团队分析了NE，LGIN，HGIN和ESCC阶段co-DEGs的表达水平，显示进行性变化的co-DEG被认为是潜在的候选基因。利用从特定样本中获得的基因表达数据，创建预测模型来预测N、L和M状态。使用机器学习模型，评估预测模型基于co- deg区分N、L和M状态的有效性（图6）。基于伪时间分析、D&K基因组合和癌化评分以及预测模型分类器的结果，研究团队将TAGLN2，KRT16和CRNN确定为潜在的候选指标。并利用定量RT-PCR验证基因的表达，与WTA结果和从TCGA数据库获得的数据一致。
图6
为评估候选基因作为ESPL指标的可行性，研究团队对验证队列中的NE，LGIN，HGIN和ESCC组织进行IHC染色，并利用IHC数据和GEO数据集验证预测模型。数据表明，即使在LGIN阶段，TAGLN5，KRT2和CRNN也可能具有作为ESPL诊断标志物的潜在效用。
5. 验证候选基因与ESCC进展之间的关联
为了研究候选指标与进展的关联，研究团队从最初被诊断为LGIN并随后进展为HGIN的患者或最初被诊断为HGIN并随后进展到ESCC进行IHC验证的患者那里获得了配对的组织样本。对所有配对进展样品的IHC评分分析显示（图7），TAGLN2和CRNN与ESCC进展相关，而KRT16不能用作ESCC进展的指标。
图7
6. 候选基因在上皮细胞类型、泛癌和预后分析中的表达
为探究候选基因是否在上皮细胞中特异性表达及其表达水平，研究团队使用已发表研究中的scRNA-seq数据进行了生物信息学分析，以评估正常和ESCC组织中TAGLN2和CRNN基因的表达（图8）。结果发现，TAGLN2和CRNN在鳞状上皮细胞中表达，这表明它们作为ESPL和ESCC诊断的候选指标的潜在效用。
图8
为评估基因表达与癌症预后之间的关系，研究团队对候选基因进行总生存期分析，发现较高的TAGLN2的mRNA表达或较低的CRNN的mRNA水平与较短的总生存期和较差的预后有关。
7. 确定候选指标在加速ESCC进展中的作用
为评估候选基因对促进ESCC进展的影响，研究团队构建了TAGLN2敲低细胞系和CRNN过表达细胞系，以评估这些候选基因在ESCC中的作用（图9）。结果表明，TAGLN2敲低或CRNN过表达抑制ESCC细胞增殖。
图9
肿瘤类器官研究表明，与对照组相比，TAGLN2敲低或CRNN过表达导致类器官数量减少。为了研究TAGLN2和CRNN在ESCC进展中的作用，研究团队从已建立的ESCC PDX模型中选择具有较高TAGLN2表达和较低CRNN表达的PDX病例。数据显示，TAGLN2敲低或CRNN过表达抑制ESCC PDX肿瘤生长，导致肿瘤体积和肿瘤重量减少，对小鼠体重没有任何不良影响。
图 10
此外，研究团队使用人类正常食管细胞系（SHEE）进行了实验，以研究这些基因在从正常细胞到恶性细胞的转化中的作用（图10）。结果表明TAGLN2和CRNN与ESCC的进展有关。此外，TAGLN2与促进ESCC进展有关，而CRNN通过调节细胞增殖参与抑制ESCC进展。
文章总结
研究团队利用空间全转录组图谱来确定预测ESPL阶段ESCC风险的潜在指标，并研究从ESPL到ESCC过渡的发病机制。研究结果表明，TAGLN2确实参与促进ESCC进展，而CRNN通过调节细胞增殖在ESCC进展中发挥抑制作用。本研究为了解ESCC发展的病理过程提供了基础信息，可作为ESCC的早期预警，有助于食管癌的预防和早期干预。
市场活动
空间多组学，非因生物领先一步！
2019-2023/深耕四年，每一步都算数！
网友评论