关键词

酶放大，持续化学发光，POCT，慢性病生物标志物

文献信息

"Magnetic Large-Mesoporous Nanoreactors Enable Enzymatically Regulated Background-Free and Persistently Signalling Diseases Diagnosis"

Adv. Funct. Mater. 2022, 2212317

DOI: 10.1002/adfm.202212317

复旦大学高分子材料国家重点实验室

摘要

多种疾病和日益增加的流行率对公共卫生构成了严重威胁。护理点检测（POCT）技术具有超过灵敏度、选择性、鲁棒性、可承受性和高通量的优越要求。然而，瞬态信号、复杂的样品预处理和低信噪比使得POCT在检测精度、效率和灵敏度方面受到严重限制。在此，本文建立了一种酶辅助磁性大介孔纳米反应器（FS），用于实现持续化学发光信号输出和消除疾病诊断中的基质干扰。采用界面共组装方法合成的核壳结构FS具有均匀的尺寸、大而开放的介孔（≈22 nm）和固有的磁可分离性。这种独特的FS可以作为限制性级联反应的高效纳米反应器，使高效的持久性化学发光（pCL）信号转导和不同生物标志物的高信噪比显色分析成为可能。所开发的pCL检测方法有助于对慢性疾病生物标志物葡萄糖和尿酸的高灵敏度测定，检测限（DL）分别为5.4 mg/L和151.2 ng/L。所提出的显色免疫分析法能够进行超灵敏和视觉测定甲胎蛋白，检测限为1.2 ng/L，这优于以前发表的免疫分析法。在159份临床血清样本中验证了所开发方法的实际应用的可行性，测定结果与临床数据吻合良好。由于不依赖昂贵的自动取样和检测仪器，预计所提出的技术将在初级医疗机构和资源有限的地区促进高度灵敏的疾病诊断。可定制的纳米反应器的良好灵活性使其成为开发各种POCT技术的有力工具，以实现快速、灵敏和准确的疾病诊断。

研究背景

酶辅助POCT诊断技术仍面临一些困难，如探针制备困难，灵敏度不足，信号短暂。

几年来，一些研究人员将酶封装进纳米材料里，以实现可控的缓慢释放并提高分析性能。介孔硅纳米颗粒被作为优异的催化支撑体，用于固定酶。

在本研究中，作者报道了一种多功能纳米反应器（FS）的合成，并证明了其在促进葡萄糖/尿酸高灵敏持久化学发光（pCL）分析和甲胎蛋白（AFP）超敏显色免疫分析方面的潜力。通过引入具有成本效益的环己烷作为扩孔剂，并使用Fe3O4纳米颗粒作为原位生长大介孔二氧化硅壳的核心，通过界面共组装方法合成了具有良好的核-壳结构、超顺磁性和大于22nm的大孔径的FS。3-糖氧基丙基三甲氧基硅烷（GLYMO）作为桥接配体，稳定固定FS大介孔中丰富的生物大分子，开发具有可定制功能的纳米探针。在这个设计中，功能化FS扮演重要的和独特的作用增强POCT应用，包括作为磁探针促进探针制备，分离目标，消除矩阵干扰，并作为载体，灵活可控的将酶和抗体固定在容易获取的开放中孔通道中，以实现持久化学发光信号输出。为了演示功能化FS的简单和多路复用能力，作者通过限制级联酶反应HRP和GOD/尿酸酶测定葡萄糖/尿酸（UA）在临床血清样本开发了pCL实验，并通过在FS共固定HRP和抗体构建一个显色酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清甲胎蛋白。本研究为设计生物大分子固定化大晶微孔纳米球和开发持久性信号转导纳米平台提供了一种通用的方法，可用于疾病生物标记物的高特异性和灵敏性的检测。

结果与讨论

1.FS的合成与表征

水分散性磁性Fe3O4由一锅溶剂热法合成。引TEA、TEOS、CTAB和环己烷分别作为碱性催化剂、二氧化硅前体、结构导向剂和扩孔剂。

表征：XRD，SAED，HRTEM，氮气吸附-解吸等温线对孔径分布、孔隙体积和比表面积进行表征。大孔径、增强FS的表面积和高孔隙率有利于大分子量生物分子的高加载效率，从而促进了酶辅助传感平台的发展。

图1.

2.FS的功能化和酶/Ab的固定

由于其较大的孔隙尺寸和较高的孔隙率，FS能够装载大量的酶/抗体来实现分析应用。特别是，超长的介孔允许有效地共固定化大分子，如GOD（水动力直径为≈8.5 nm）和/或抗体。在酶和抗体固定化之前，将GLYMO接枝到介孔硅壳的孔壁上，通过醇解反应生成FS-环氧树脂。然后，抗体/酶通过酶/抗体的胺基与GLYMO的环氧基之间的亲核反应共价连接到FS-环氧酶，从而得到FS-环氧酶（-Ab）（FS-E(A)）（图2a）。

对FS的环氧化作用和酶/Ab在FS介孔中的固定进行表征。FS-E (A)的基本线扫描光谱显示了多孔壳中的核壳结构和酶/抗体的分布（图2b）。为了进一步阐明抗体/酶在FS上的固定化，通过能量色散光谱（EDS）元素映射确认了Fe、Si、O、N和S的共存和均匀分布，表明抗体/酶成功地分散负载在介孔二氧化硅壳中（图2c）。用DLS测定HRP、GOD、尿酸酶、Fe3O4 NPs、FS和FS-E (A)在水溶液中的平均水动力直径分别为4.0、8.5、3.2、306.8、462.4和638.9 nm（图2d）。Fe3O4 NPs、FS和FS-E (A)的Zeta (ζ)电位分别为−34.8、−23.7和−20.6 mV（图2e）。在涂层介孔硅壳和固定化生物大分子后，由于亲水基团的增加，纳米球的水化颗粒尺寸逐渐增加，水化层逐渐变厚，表明酶和抗体的固定化成功。与Fe3O4 NPs相比，在FS的FTIR光谱中，新出现的1075 cm−1的O-Si-O伸缩振动吸收带表明介孔硅壳涂层成功。与FS相比，FS-E(A)的FTIR光谱显示了几个新的特征吸收带在2800−3500 cm−1和1350−1590 cm−1，分别归因于胺基团的N-H拉伸振动和C-N拉伸带，进一步证实了抗体和酶的成功固定（图2f）。

图2.

3.比色和持久化学发光信号转导

过氧化物酶以H2O2作为电子受体催化其底物氧化而闻名。Fe3O4 NPs具有协同作用，在弱酸性环境中用辣根过氧化物酶催化它们的底物用显色。通过记录在H2O2存在下3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(TMB) (652 nm= 39,000 M-1 cm-1) 的氧化反应记录催化反应。通过记录652 nm (OD)光密度测定TMB的催化氧化显色反应。与Fe3O4 NPs和FS相比，FS-环氧- HRP (FS- H)催化的显色反应的OD值最高(图S13-S15a)。FS- H、Fe3O4 NPs和FS的催化活性单位与各自的重量成正比，其单位斜率分别为13.01、3.52和1.56 U/mg，分别表示FS- H、Fe3O4 NPs和FS的比活性 (图S15 b)。上述结果清楚地表明FS- H具有优异的过氧化物酶样活性，这是由于FS的大而可接近的中孔中牢固地固定了大量的HRP。此外，经计算，FS-H对TMB和H2O2的米氏常数(KM)分别为0.50 mmol/L和0.68 mmol/L，表明FS-H对TMB和H2O2具有较高的亲和力(图S 16)。因此，FS可以作为高效酶促反应的载体。

为了研究FS系列探针的显色和着色性能，记录了组分和浓度依赖的显色/CL动力学。选择典型显色底物TMB和化学发光底物鲁米诺分别进行显色反应和化学发光的传感信号转导。对溴酚(p-Br)的引入可以显著增强鲁米诺的化学发光FS-H/H2O2能催化TMB底物在溶液中的氧化，并诱导出可见的蓝色。FS-H/TMB溶液的OD值在前10 min内增加，加入H2O2后趋于平稳 (图3a)。FS- H /H2O2也能快速催化发光底物的氧化，并产生超过15 min的强而持久的CL，这是由于FS中催化活性单元的高密度和缓慢扩散导致的持续发光反应 (图3 b)。显色反应的OD值在0 ~ 8.0 mg/L范围内，pCL强度与FS-H浓度呈正相关。这种有效的底物催化氧化有利于酶催化辅助定量分析。

GOD可以有效地催化葡萄糖氧化生成H2O2，尿酸酶可以催化UA氧化生成H2O2，在HRP的催化下诱导后续的化学发光。因此，在FS的大介孔中，通过与HRP共固定GOD或尿酸酶，进一步进行了受限级联酶反应(图S17, S18)。FS -环氧-HRP & GOD (FS-HG)/葡萄糖和FS -环氧- HRP & uricase (FS-HU)/UA均能催化发光氨氧化并产生pCL, CL强度呈浓度依赖性(0 8.0 mg/L FS-HG；0 -10.0 mg/L的FS-HU)，由于中间产物的局部浓度提高，扩散障碍减少，限制级联反应的生物催化效率提高(图3 c, d)。特别是，无论酶的固定顺序如何，获得的FS-HG和FS-HU分别可用于不同浓度的葡萄糖和尿酸的传感，具有持续、稳定和增强的化学发光信号输出，可长时间采集(图S19, S20)。相比之下，当酶分散在溶剂相中检测不同浓度的葡萄糖和尿酸时，获得的信号是不稳定的(图S21, S22)。因此，FS系列探针可用于显色和pCL分析，用于分析物的测定，pCL具有持久、恒定、不需要激发的特性，可在大时间范围内采集无背景、精确的信号，有利于提高分析精度和灵敏度。

图3.

4.持续化学发光pCL用于体外癌症诊断

CL作为一种由化学反应引起的发光物质，已广泛应用于无自身荧光生物传感器和生物成像然而，传统的以秒为单位的闪光型光的CL分析方法往往存在信号采集困难，从而导致分析的重现性和准确性较差。与传统诊断性化学发光试剂从昂贵的自动采样和测试仪器上采集闪光信号相比，pCL具有持久、恒定、不需要激发的特性，可以在大时间范围内采集无背景、精确、可重复的信号，从而有利于提高信噪比、分析精度和检测灵敏度。因此，pCL在高性能CL检测方面非常有前景，并有望在基层医疗机构和资源有限地区促进高灵敏度疾病诊断。作为概念验证，本文以葡萄糖和UA为模型分析物，验证FS系列探针pCL检测在慢性疾病诊断中的应用潜力。

葡萄糖对机体代谢平衡至关重要。血液中的葡萄糖浓度是人体健康的关键指标。监测和控制血糖可有效避免高血糖并发症的发生，如肾衰竭、心血管疾病、失明、心脏病。在FS-HG-pCL实验中，GOD能有效催化葡萄糖氧化生成H2O2，在GOD和HRP的高效级联催化下，产生发光溶液的pCL信号，从而实现葡萄糖的高灵敏度测定(图4a)。CL强度随葡萄糖浓度的对数线性增加，从18.0到3747.3 mg/L (图4 b)。11个重复测定180.2 mg/L葡萄糖的RSD为3.8%。基于FS - HG的pCL测定法在葡萄糖测定中表现出高特异性和抗干扰能力，DL为5.4 mg/L (30.1 umol/L)，这与以前报道的一些方法相当，允许稀释数十倍来测定血清葡萄糖 (图4c; 图S23; 表S1)。此外，所建立的FS - HG - pCL法成功应用于人血清葡萄糖的测定。结果显示与日立7600自动分析仪(H7600)记录的临床结果具有良好的相关性(相关系数R = 0.9563) (图4 d; 图S 24)。

血清UA异常(高尿酸血症或低尿酸血症)与痛风性关节炎、2型糖尿病、慢性肾病、心血管疾病、多发性硬化症或氧化应激等有关。成人血清UA正常范围为21.9 - 77.3 mg/L，需要对UA进行高灵敏度测定。UA可酶解生成尿囊素和H2O2，在HRP存在下，鲁米诺原位催化氧化产生的pCL信号生成H2O2 (图4e)。FS-HU/CL溶液的CL强度与UA浓度呈负相关 (图S 25)，这可以归因于尿酸具有优越的抗氧化性能一方面，尿酸被尿酸酶催化氧化产生H2O2并激活CL; 另一方面，它的还原性抑制了CL。在以FS - hul为基础的抑制pCL实验中，在0.5-64.6 ug/L的宽范围内，CL - CLs下降强度(CL - CLs)随UA浓度的对数线性增加 (图4 f)。11次重复测定88.4 μg/L UA的RSD为3.7%。基于FS - hul的抑制pCL检测具有较高的特异性和抗干扰能力，其DL为151.2 ng/L (0.9 nmol/L)，与之前报道的一些方法相当，甚至远低于，表明在临床UA检测中具有很大的应用潜力(图4 g; 图S 26; 表S 2)。因此，所建立的FS - hul抑制pCL检测进一步应用于人血清UA的定量。结果与对H7600的临床检测结果吻合良好(R = 0.9453)，证实了FS - hu为基础的抑制pCL检测在临床应用中的可行性(图4 h; 图S 27)。上述结果表明，所建立的pCL检测方法具有较高的准确性和潜在的体外临床诊断适用性。

图4.

5.比色免疫分析用于体外癌症诊断

图5.

研究结论

综上所述，作者报道了在双液相体系中通过界面共组装轻松合成了核壳结构均匀、介孔大而开放、亲水性好、可修饰位点丰富、磁响应快的FS。利用环氧硅烷的桥接作用，成功地将FS作为抗体和酶的载体应用于多功能纳米探针的设计中。FS大介孔中大量酶的固定使其具有良好的信号转导性能，便于后续测定各种血清生物标志物。FS-H&Ab1被引入用于高效显色反应，并成功地集成到免疫测定中，用于高特异性和超灵敏地测定血清大分子生物标志物AFP，其DL为1.2 ng/L，优于先前发表的免疫测定方法。特别构造了FS-HG和FS-HU用于级联酶促反应，并成功配置到pCL分析快速，高度特异性和敏感的测定血清葡萄糖(DL,5.4 mg/L)和UA (DL,151.2 ng/L)。这种设计良好的具有大而开放介孔结构的可磁分离FS可以作为传感阀固定化多种生物大分子，从而为进一步探索和丰富其他分析物(如疾病标志物、食品污染物和环境污染物)的酶辅助传感平台铺平了道路。