转录组学研究有两种，一种是基于分子杂交技术（【现学现卖】实验-DNA芯片）的微阵列数据的研究；第二种是对高通量测序（【现学现卖】实验-DNA测序）的数据进行的研究。
一、RNA-seq应用
今天这篇文章想要聊聊的就是第二种——RNA sequencing，简写为RNA-seq。它基于高通量测序的转录组测序技术，分析给定时刻，生物样品中mRNA，small RNA，Non-coding RNA等或者其中一些RNA的存在和数量，分析基因表达随时间或不同处理的变化（different gene expression，DGE分析是RNA-seq的主要应用）。RNA-seq还可用于查找可变剪接转录本（alternative gene spliced transcripts），转录后修饰（post-transcriptional modifications），基因融合（gene fusion）/突变/SNP等，确定外显子/内含子边界并验证或修改先前注释的5'和3'基因边界。RNA-Seq的最新进展还包括单细胞转录组学（ single cell sequencing）和固定组织的原位测序（ in situ sequencing of fixed tissue）。
二、实验流程
RNA-Seq对转录组进行测序和分析的工作流程包括：（1）提取RNA，富集mRNA或消除rRNA，合成cDNA和构建测序文库。（2）高通量测序，主要是illumina产生short reads，也有使用PacBio long reads等其他测序平台。（3）对数据进行分析：质控、比对、拼装、样本间数据过滤和标准化、差异基因表达分析、SNV分析等。
https://en.wikipedia.org/wiki/RNA-Seq#Library_preparation
（1）构建用于测序的文库，以构建mRNA的cDNA文库为例。提取RNA，并用DNase处理，好的RNA提取质量是后续构建文库和测序数据质量的保障→RNA筛选，如果是mRNA就可以通过3'的polyA尾巴来筛选，获得mRNA材料。→cDNA合成，将RNA反转录为cDNA是因为DNA在后续操作中更加稳定，而且一些生物技术在DNA上更成熟。→片段化后筛选收集合适大小的片段，完成文库构建。
（2）测序。最常用的是illumina的短读长测序平台，后来还有长读长的测序平台PacBio，以及直接测序的Oxford Nanopore，它们的对比见下图。【现学现卖】实验-DNA测序
https://www.nature.com/articles/s41576-019-0150-2
short read测序发展早，应用广，产生高通量数据，在发现转录异构体方面受限；而longread测序适合发现转录异构体，但是通量相对低。两种测序各有优缺点。刚刚蝴蝶和我在eurofins（illumina的平台）网站提交了一个NGSelect RNA报价申请，等了一年经费审核，终于我的小菌菌要做NGS啦，可喜可贺！（撒花儿
）
（3）分析。转录组拼接（transcriptome assembly），采用de nove，genome guided等方法，将raw sequence reads组装为contigs ，评估拼接质量的指标包括contigs长度位数，contigs数目和N50（有一些概念在这个文章后面提过【现学现卖】链霉菌的全基因组分析（1））。→组装好后可以根据不同目的进行分析，比如分析两个处理转录本间基因表达量差异（需要内参或者其他方法标准化数据再进行比较），可变剪接等（有些可以公司分析）。而我的实验目的是寻找真菌中的病毒，在测序公司递交任务的时候，很多后续分析的选项都不用勾选。
三、如何获得更好的做RNA-seq
测序时有很多参数可供选择，根据实验目的，RNA材料selection，建立文库，测序深度，单端/双端测序，reads长度等参数都要选择。就我的实验来说，选择的是建立标准cDNA文库，RNA selection包含mRNA和非编码的RNA，2×150的paired-end测序。根据需要选择参数后测序，得到很多reads，对它们进行拼接和组装，blast，分析可能存在的病毒。
而多数RNA-seq目的是分析样品间转录组差异，分析过程包括reads的比对和组装，定量转录本丰度，过滤和标准化，差异表达分析。
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