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实验室——质控上机组

终于终于终于历经九九八十一个关卡，来到最后一步啦，质控上机主要由质控、Pooling、上机三步组成，下面让我们慢慢揭开这神秘的面纱，一起探索基因序列的奥秘吧！

主要通过QPCR(实时荧光定量核酸扩增检测系统)一边对DNA片段进行扩增，一边实时连续检测样本荧光值变化,从而检测DNA浓度。关于荧光基团的加入，主要有以下两种方法：

1.质检

①SYBR Green I法

在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green I(是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料),在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。

②TaqMan探针法

Taq Man探针是一段可以和被测序列互补的寡核苷酸，其两端分别标记有一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

特别注意的是，SYBR Green I可与所有DNA双链结合，因此不完全精确，且随着DNA双链被解开，荧光消失；TaqMan探针法与目的片段特异性结合，且不会随着DNA解链而消失，但成本较高。

2.Pooling。Novaseq 6000一次测序容量为4.8~6.0T，而一个人的基因组仅约3G，为了节约时间和成本，通常将许多文库按照一定浓度、比例混合，一起上机测序。可通过接头中的index区分不同文库。

3.上机。Novaseq 6000 & Miseq

①原理：两者均通过带荧光标记的核苷酸与被测片段互补配对释放荧光，从而边合成边测序。且两者均可进行双端index识别，更加精确

②区别：前者测序量更大(6T)，最大读长为500bp；后者测序量较小(15G)，最大读长为600bp,相比Novaseq 6000而言，体积更小，处理时间更短。