高通量测序原理

测序类型

• ROCHE/454 测序
• illnumina 测序
• Pacbio 测序
• nanopore 测序

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主流的NGS测序技术：Roche/454 、Illumina/HiSeq 2000 、 Applied Biosystems/SOLID.Illumina 的测序技术
其中* Applied Biosystems/SOLID.Illumina*最为成熟。

目前 基本不用 Roche/454

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一、Illumina测序

1：主要流程

• 提取核苷酸
• 质量评估
• 连接接头
• 文库定量
• 将模板链杂交到测序反应面上
• 扩增模板序列
• 线性化
• 固定测序引物
• 边合成边测序
• 碱基判读和分析结果

以HiSeq系列为主。它的机器采用的都是边合成边测序的方法，主要分为以下4个步骤：

• 300bp-800bp长的序列片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头

  
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• 测序流动槽（flowcell）

  
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• 桥式PCR扩增与变性

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• 测序

添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4中dNTP（如同Sanger测序法）。
dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP，这就确保了在测序过程中，一次只会被添加一个碱基。同时在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。
这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。

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• 单端Index

• 双端Index

  
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二、Pacbio测序

零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs）和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上（Phospholinked nucleotides）。

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测序原理

• 文库构建是将长片段DNA分子与测序接头连接形成茎环结构
• 加上与接头互补的测序引物及DNA聚合酶分子；上机测序是将构建好的文库复合物放入PacBio RS测序仪上，并载入测序芯片SMRT Cell的纳米孔中，DNA聚合酶分子通过共价结合固定在纳米孔底部，通常一个纳米孔固定一个DNA分子。
• 在SMRT Cell芯片孔中，加入DNA聚合反应所需底物dNTP及缓冲液，4种dNTP带有四色荧光标记基团。
• 根据模板链核苷酸顺序，相应的dNTP进入DNA模板链、引物和聚合酶复合物中发生链延伸反应，同时dNTP荧光信号通过零模波导（zero-mode waveguide，ZMW）检测获得荧光信号图像，经计算分析得到DNA碱基顺序。

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三、Nanopore测序

单分子实时测序的新技术

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• 解螺旋，将双链DNA解开成单链。
• DNA单链分子通过一个孔道蛋白，孔道中有个充当转换器的蛋白分子。
• DNA单分子停留在孔道中，有一些离子通过带来电流变化，而不同的碱基带来的电流变化是不同的。
• 转化器蛋白分子感受5个碱基的电流变化。

• 根据电流变化的频谱，应用模式识别算法得到碱基序列。

  
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优点

• 轻便
• 它的读长很长，可以达到30-40万个碱基。

缺点

• 判断碱基的准确性还是比较低
• 数据的产量也比较低
• 试剂的稳定性还有待提高

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Nanopore 和 PacBio的区别

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不同代测序的区别

不同类型测序区别

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