获得酶准确的等电点和疏水性参数，对酶的分离纯化有很大的帮助。精确测量酶等蛋白质等电点的常规技术是二维电泳（2-dimensional electrophoresis, 2-DE），但有时受到实验条件限制或者出于成本考虑，无法直接使用2-DE测量酶的等电点。另一种估计酶等电的方法就是阴阳离子柱筛选，我们以Taq DNA Ligase（UniProt编号：P26996）为例说明一下一般的操作流程：
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使用预测软件/网站估算Taq酶的pI，比如使用IPC和ProtParam，IPC计算结果为6.42，ProtParam计算结果为6.66，根据我对这两个网站计算结果的比较，IPC的结果一般准确一些，但这里我们折中一下，取6.50；
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选择Q、SP阴阳离子对柱料，各取0.5mL 50%的填料分装到8个离心管中，配制50mM pH5.5、pH6.0、pH6.25、pH6.5、pH6.75、pH7.0、pH7.25、pH7.5（一般取[pI-1, pI+1.5]区间的值）并含50mM NaCl的 Tris-HCl缓冲液，然后使用pH梯度缓冲液反复冲洗离子对填料3～5次，弃去上清；
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将Taq酶样品（溶解于低盐离子浓度的10mM Tris-HCl@pH8.0缓冲液中），依次加入到上述阴阳离子对填料中，上下颠倒充分混匀后，静置20min，然后离心取上清检测Taq酶含量；
阴阳离子对测定Taq连接酶等电点.jpg
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pH&pI、蛋白荷电状态、离子交换的关系
| 关系 | 电荷 | 吸附 |
|---|---|---|
| pH>pI | 负 | 阴离子柱吸附 |
| pH=pI | 0 | 无吸附 |
| pH<pI | 正 | 阳离子柱吸附 |
利用上述表格，根据步骤3的结果，不难推断Taq的pI<7.4，最后我们根据离子对的筛选结果推测，Taq的pI接近7.0偏酸性，但比预测值要高。
预测软件计算出的理论pI，一般与实际值存在较大误差，因为这些软件都是直接将氨基酸氨基侧链的pKa进行数学叠加得出的，虽然不同软件采用不同的计算权重，但它们都默认为酶的所有残基都是暴露在表面的，实际上酶在溶液中有很多残基是包埋在内部的，甚至包括一些酸、碱性残基，把这些残基从酶的氨基酸序列剔除，能够提高等电点预测的准确性。此外，酶的疏水性参数预测也存在相同问题，如何剔除包埋到内部的残基，提高等电点和总平均亲水指数预测的准确性，请参考《利用PISA提高蛋白质等电点预测准确性》。
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