在CRISPR/Cas9基因组编辑实验中，如果你已经构建好了gRNA表达载体，并利用Cas9将它引入了目标细胞，那么恭喜你！成功就在眼前，指日可待。下一步，你还要验证一下，看看细胞的编辑是否如你所愿。在此，一些专家给你提了一些建议。
验证的方法将因物种和编辑类型而异。在这里，我们主要关注二倍体的哺乳动物细胞，不过许多原理也同样适用于其他的模式生物。
在细胞中引入
Cas9和gRNA，将带来混合的细胞群体。双链断裂（DSB）产生之后，细胞内的修复机制通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）来起
作用。哺乳动物细胞的修复以NHEJ为主，这就带来了插入缺失的错误。不过引入的插入缺失存在异质性，而等位基因编辑的频率也有所不同。有的细胞没有被编
辑，有的只有一个等位基因被编辑，而有的则有两个。同源定向修复则需要修复模板的存在。
验证过程的第一步是快速评估是否有一定量的细胞被编辑。对于插入缺失而言，可通过错配切割分析来观察。对于HDR，往往可通过限制图谱的改变或报告基因的读数来观察。对于缺失，你可以通过特殊设计的PCR引物来判断。
一旦你知道有一部
分细胞经过了编辑，那么你可以继续创建克隆细胞系。利用连续稀释，来分离单个细胞，接着进行扩增产生细胞系。如果你的质粒上有荧光蛋白的标记，那么可通过
FACS来富集含有Cas9和gRNA的细胞。扩增后，分析每个细胞系，并测序目的区域，以验证编辑是否如你所愿。如果可能，你还可以开展western
blot。
错配切割分析
错配切割分析是一种快速而简单的插入缺失检测方法。此过程中通常使用Surveyor核酸酶，因为它切割DNA双链3’端的任何错配。它能够检测多达12个核苷酸的插入缺失，对频率低至1/32的突变敏感。
此分析通常包含四
个步骤：1. PCR扩增目标区域；2. 变性并再次杂交，让突变型和野生型的链退火；3.
用Surveyor核酸酶处理退火的DNA，以切割异源双链；4.
琼脂糖凝胶电泳分析DNA。在这个例子中，两个+gRNA的泳道都包含了预期大小的片段，表明gRNA成功产生了插入缺失。这种分析通常是半定量的，你可
以看出gRNA1似乎比gRNA2更有效。
（图片来自Addgene）
检测同源定向修复
如果你希望利用HDR来实现突变，那么你最好先确定gRNA是否能高效切开你的目标序列。这可以参考上面的错配切割分析。一旦你选择了最佳的gRNA，就可以引入它和Cas9以及你的修复模板。
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