RIP实验步骤(RNA Immunoprecipitation)

原创 如期生物

  RIP 技术用于定位体内的RNA-蛋白质相互作用。将所关注的RNA结合蛋白(RBP)与其结合的RNA一起进行免疫沉淀，鉴定结合转录RNA（mRNA、非编码 RNA或病毒RNA）。可以通过实时PCR、微阵列或测序检测。

RIP实验步骤：

一、裂解样本

1. 细胞生长约90%覆盖度，细胞计数，收件约1× 10 ^7细胞；

2. 1000 ×g，4 °C离心5min，弃上清；

3. 用1× 预冷PBS洗两遍，弃上清；

4. 用等体积的1×PLB裂解液重悬细胞，轻轻吹散，冰浴5min；

5. −80 °C冻存，样品也可以在−80 °C放置数月。

二、磁珠-抗体复合物制备

1.    振荡混匀Protein A/G琼脂糖珠，根据样本数各吸取40ul到1.5mL离心管中；用0.5ml NT-2洗涤两遍。

2.    用100ul NT-2重悬Protein A/G琼脂糖珠，并加入5ug目的抗体或IgG抗体。室温翻转孵育1h.

3.  4℃, 4000转离心1min,去上清。

4.    用1ml NT-2 重悬Protein A/G与抗体复合物，4℃ ,4000转离心1min,去上清。重复该步骤5次，共洗涤6次。

5.    用900ul NET-2重悬Protein A/G与抗体复合物。

三、蛋白与RNA复合物沉淀

1.    冰上解冻细胞裂解物，17000*g 4 °C离心10min。取10ul裂解物上清作为input，于-80℃冻存，最后与RIP产物一起提取RNA。吸取100ul上清液到900ul的Protein A/G与抗体复合物中，4 °C翻转孵育过夜；

2.孵育完成后，4℃, 4000转离心1min,去上清；

3.   用1mL预冷的NT-2重悬Protein A/G复合物；并用涡旋仪震荡15s。4℃, 4000转离心1min,去上清；

        4.  重复上步骤5遍，共洗涤6遍（如果出现IGG组背景比较高的情况，可多洗涤几遍）

       5.  用150ul Proteinase K buffer重悬Protein A/G复合物；另外input样本中加入107ulNT-2，15ul 10%的SDS及18ul Proteinase K。于55 °C孵育30min。

       6.   加入1ml trizol 进行RNA提取（并用6ug糖原沉淀RNA）。

       7.   用等体积的RNA进行反转录及qpcr检测（如果10%input的RNA浓度过高，可稀释10至1%input 进行反转录）

(由于RNA提取与qPCR分析为常规使用操作，在此次就不再细讲，有需要的详细了解的朋友可以私聊讨论哈）