mRNA-seq学习（二）：Bowtie2比对

1. 比对之前需要考虑哪些问题

1. 选什么作为参考序列

• 基因组序列
  既能做表达定量，还能发现新的基因和转录本
• 转录本序列（CDS / cDNA / 基因集）
  表达定量

2 gff/gtf的作用

• 在比对的过程中，提供基因组注释文件可以指导spliced reads的定位
• 在统计reads数的时候，提供区间参考

3 选择合适的比对工具

主要考虑是否需要spliced alignment
Bowtie、bwa

• 原核生物没有内含子，不存在可变剪接
• 小RNA的产生也没有可变剪接过程
• 比对到转录本序列（因为已经是接好的序列）

Tophat、STAR、hisat2

• 比对到基因组且基因有内含子

2. Bowtie2比对

2.1 Bowtie与Bowtie2有什么区别

• Bowtie更适合短序列的比对，如小RNA测序reads; 另外它不允许gap
• Bowtie2更适合长序列（50碱基以上）的比对；允许gap

2.2 建索引

bowtie2-build -f Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna.toplevel.fa TAIR10.bybowtie

$ ls
TAIR10.bybowtie.1.bt2  TAIR10.bybowtie.3.bt2  TAIR10.bybowtie.rev.1.bt2
TAIR10.bybowtie.2.bt2  TAIR10.bybowtie.4.bt2  TAIR10.bybowtie.rev.2.bt2

2.3 比对

bowtie2 -q --phred33 -p 8 --no-unal -x TAIR10.bybowtie \
-1 SRR3286804_1.fastq.gz -2 SRR3286804_2.fastq.gz -S SRR3286804.sam

#参数说明
-q: 输入文件为fastq
--phred33: 测序碱基的质量体系，现在基本都是33
-p: 线程数
--no-unal：不保留未必对上的记录
-x：索引前缀
-S：sam格式输出