影响因子：8.2
研究概述：睾丸生殖细胞肿瘤（TGCTs）被认为是最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一。睾丸肿瘤细胞的高度侵袭性是肿瘤复发和不利临床结果的重要预后指标。针对PD-1/PD-L1系统的检查点抑制剂在各种癌症中的临床效果显著，先前的研究表明PD-L1表达的肿瘤浸润性淋巴细胞在精原细胞瘤标本中的预后意义。在本研究中，作者基于免疫相关基因开发了一个预后签名。随后的验证和分析表明，这个签名可靠地预测结果和对免疫疗法（ICI）的敏感性。此外，作者鉴定了三种小分子抑制剂或激动剂，能够调节这些签名基因的表达。这项研究是第一次尝试构建一个免疫相关签名，以预测疾病进展和精原细胞瘤患者对免疫疗法的反应。具体研究如下：
研究结果：
免疫相关关键基因
在比较66个精原细胞瘤样本和165个正常睾丸组织的差异表达分析中，作者共鉴定出766个差异表达的免疫相关基因（IRGs），其中511个在精原细胞瘤中上调，255个下调（图a和b）。为了识别免疫相关关键基因，作者对候选基因（n = 766）进行了WGCNA分析。通过层次聚类和最佳软阈值，作者划分出两个不同的模块（图c）。其中绿松石模块与精原细胞瘤呈高相关性（相关系数cor = 0.96，P < 1e-200），随后杂志选择MM值大于0.5的绿松石模块中的基因进行进一步分析。作者将总共690个模块基因输入STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络（图e）。使用Cytoscape中的MCODE插件可视化和分析网络，作者发现一个显著的聚类（MCODE得分为31.947，包含39个基因）（图f）。基于这些39个关键聚类基因的GO分析表明，它们在“细胞因子介导的信号通路”和“质膜外侧”富集（图g）。此外，根据KEGG分析，“细胞因子-细胞因子受体相互作用”途径作为最显著的途径出现，位于途径网络的中心位置（图h）。
免疫相关预后签名（IRPS）构建和表达验证
为了确定独立的预后基因，作者在39个免疫相关基因中进行了无进展生存（PFS）分析，以评估它们与生存的关联。随后，对这些与生存相关的基因进行了单变量Cox回归分析，选择了CTLA4、SNX17、TMX1和TBX21四个基因进行最LASSO回归分析（图a）。基于AIC值（图b）进行评估后，这四个基因进入多变量Cox回归分析。最终，使用公式：CTLA40.66+ SNX170.33 + TMX1*0.37，构建了基于CTLA4、SNX17和TMX1的免疫相关预后评分（IRPS）。这三个签名基因在精原细胞瘤组织中的表达水平高于正常睾丸组织。然而，尽管CTLA4在复发（R）样本中的表达下调，TMX1和SNX17在复发样本中相对于非复发（NR）样本表达上调（图d）。值得注意的是，TMX1和SNX17的表达水平越高，复发风险越大，因此它们被归类为风险基因。相反，CTLA4被确定为保护基因。为了验证三个签名基因的表达模式，作者对38个精原细胞瘤样本及其相应的邻近正常组织进行了qRT-PCR分析。与前述分析一致，所有三个IRPS基因在精原细胞瘤样本中的表达上调（图e）。此外，TMX1和SNX17在复发样本中表达上调，而CTLA4在复发样本中表达下调（图f）。免疫组化（IHC）蛋白染色证实了这些发现，显示出与mRNA表达一致的结果（图g）。
免疫相关预后签名（IRPS）的预后验证
利用上文筛选出的3个预后基因，样本根据IRPS风险评分被分为高风险组和低风险组。与高风险组相比，低风险组的患者在无进展生存期（PFS）方面表现出更好的结果，这在TCGA-TGCT队列（图a，P < 0.001）和验证队列GSE99420（图b，P = 0.012）中都很明显。此外，随着风险评分的增加，作者观察到更高的复发率和更短的进展生存时间（图c-d）。主成分分析（PCA）散点图显示IRPS可以有效区分样本（图e）。此外，GSVA分析揭示了低风险组中“细胞因子”途径的显著富集，以及高风险组中“错配修复”途径的显著富集（图f）。
接下来作者探究其预测能力。IRPS对1年、3年和5年生存率的AUC值分别为0.802、0.899和0.943（图a）。与年龄（AUC = 0.636）、分期（AUC = 0.507）、T分期（AUC = 0.641）和淋巴血管侵犯（LI）（AUC = 0.603）相比，IRPS展现了更高的AUC值0.943（图b）。单变量Cox回归分析表明风险评分是精原细胞瘤患者的独立风险因素（p = 0.008, HR = 1.063, 95% CI = 1.016–1.112）。然后，基于RMS分析只有IRPS被确定为精原细胞瘤患者预后的风险因素（HR为1.063，95% CI为1.016–1.112 ，p=0.008）（图f）。随后作者建立了一个列线图，包括临床病理特征（年龄、分期、T分期、LI）和新的IRPS（图g）。在这个综合列线图中，IRPS模型在这些临床相关协变量中展现了显著的影响，与前面的RMS和多变量Cox回归分析的结果一致。随后，作者进行了单变量和多变量Cox回归分析以评估列线图。值得注意的是，在将列线图与混杂因素整合后，LI不再是风险因素，而列线图仍然显著（图h-i）。最后作者构建并使用DCA评估了四个模型的预测能力。模型1包括年龄、分期、T分期、LI和血清标志物（LDH、HCG和AFP）；模型2包括CTLA4表达、TMX1表达、SNX17表达、风险评分和列线图；模型3整合了T分期、LI、风险评分、列线图和血清标志物；模型4涉及LI和风险评分。模型4与其他三个模型相比展现了更优越的净收益（图j）。在模型4中观察到净干预措施的最大减少（图k）。
免疫微环境探索
作者使用CIBERSORT分析来评估高风险组和低风险组之间22种肿瘤免疫细胞浸润模式的差异。作者发现了天然B细胞、记忆B细胞和T细胞浸润的显著差异（图a）。此外，B细胞浸润模式的差异可能与TMX1和SNX17表达相关（图c）。TMX1和SNX17表达水平的升高与记忆B细胞比例的降低和天然B细胞比例的增加相关，最终影响PFS（图d和e）。此外，CTLA4表达水平的增加与T细胞比例的升高相关，并改善了PFS（图f）。作者还检查了高风险组和低风险组之间免疫功能的差异（图b）。值得注意的是，与抗原呈递细胞（APC）共抑制、APC共刺激、CCR、检查点调节、细胞毒性活性、HLA、炎症促进、副炎症、T细胞共抑制和T细胞共刺激相关的免疫功能在高风险组中明显受到抑制。此外，高风险组患者的TIDE（图g）和功能障碍评分（图h）较低，而排斥评分较高（图i）。高风险组中预测对免疫疗法有反应的患者比例更高（p < 0.01，图j）。最后作者将睾丸肿瘤作为对照细胞，肾门淋巴结作为处理细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。作者发现CTLA4主要在T细胞中表达（图k和5l）。此外，与睾丸肿瘤相比，肾门淋巴结中T细胞的分布减少（P < 0.001，avg_log2FC = 7.99）。值得注意的是，TMX1在平滑肌细胞、单核细胞和巨噬细胞中表达显著，与睾丸肿瘤相比，TMX1在肾门淋巴中的平滑肌细胞和巨噬细胞中表达上调。与对照细胞相比，SNX17在NK细胞、B细胞和巨噬细胞中表达显著，这些细胞中的SNX17表达上调。
分子筛选、对接和模拟
作者从Pubchem数据库中获取了可能上调CTLA4、下调TMX1和SNX17的潜在分子。在与分子数据库对接后，ICG-001、Rutin和Doxorubicin显示出与相应蛋白质复合物结合能量最低（ΔGMMGBSA=-30.48，-27.39，-17.23 KCal/Mol）和连接键最多的特性；由两个关键指标描绘：RMSD（均方根偏差）和R(g)（半径回转）。在模拟过程中，作者识别出低能区域，表明分子采取各种相互作用模式或构象以达到最小能量状态。作者计算了蛋白质和小分子之间的RMSD值，并可视化了RMSD趋势（图a-c）。这一发现显示，在三个模拟的最初100纳秒内，蛋白质和小分子之间的RMSD值在逐渐稳定之前表现出相当的变异性。在整个模拟过程中，RMSD值始终保持在较窄的范围内，表明蛋白质和小分子之间有稳定的结合。Gyrate分析显示，与小分子结合后，蛋白质的Gyrate相比于单独的蛋白质分子有所减少，表明小分子的结合导致蛋白质分子的紧凑性增加（图d-f）。
ICG-001、Rutin和Doxorubicin均能抑制Tcam-2细胞的体外增殖和侵袭能力体内试验
为了评估复发和非复发精原细胞瘤组织中IRSGs表达模式和免疫细胞浸润模式的差异，进行了免疫荧光实验（下图）。值得注意的是，在非复发精原细胞瘤组织中观察到CTLA4表达水平的升高，同时伴随着CD3荧光信号的增加。相反，TMX1和SNX17在复发精原细胞瘤组织中表现出上调，与记忆B细胞（CD27）浸润的减少相一致。在复发患者中作者还注意到了Vimentin的上调，Vimentin是细胞侵袭活性的指标，表明增强的侵袭和转移潜力，预示着更高的复发率。
前文提及作者找到了三个潜在的药物。于是作者进行了功能试验进行验证。在38.19mmol/L的Rutin、10.96mmol/L的ICG-001和0.3994mmol/L的Doxorubicin浓度下，确定了这些药物对Tcam-2细胞IC50。与对照DMSO组相比，在2天、4天和3天后分别观察到最明显的Tcam-2细胞受抑制程度（图a）。经过Rutin处理后，CTLA4的mRNA和蛋白表达水平上调。相反，Doxorubicin和ICG-001处理导致TMX1和SNX17的mRNA和蛋白表达水平分别下调。应用这三种分子处理后，Tcam-2细胞的集落数量减少（图b）。为了研究这三种分子化合物对Tcam-2细胞转移潜力的影响，作者进行了划痕和transwell实验。与对照组相比，用这些化合物处理的细胞显示出减少的迁移能力，尤其是Doxorubicin尤为明显（图c）。值得注意的是，Rutin、ICG-001和Doxorubicin显著阻碍了Tcam-2细胞的迁移和侵袭能力（图d）。这一效应与E-钙粘蛋白表达水平的升高和波形蛋白和N-钙粘蛋白表达水平的降低相一致（图e）。
为了验证体外实验的结果，作者进行了睾丸癌异位移植实验，并进行了睾丸异位移植的肿瘤照片留取和H&E染色（图a）。作者从睾丸中切除肿瘤组织（图b），并对其重量和体积进行了评估。与DMSO对照组相比，Rutin、ICG-001和Doxorubicin处理组的肿瘤重量和体积都较小。随后，对肿瘤组织进行了CTLA-4、SNX17和TMX1的染色（图c）。Rutin处理导致肿瘤组织中CTLA-4蛋白表达上调。相反，ICG-001和Doxorubicin处理分别下调了SNX17和TMX1的表达。此外，这三种分子化合物的处理上调了E-钙粘蛋白的表达，并下调了N-钙粘蛋白和Ki-67的表达，表明抑制了增殖和侵袭能力（图d）。
研究总结：
本研究思路比较简单，生信分析加湿实验。本研究针对晚期精原细胞瘤患者中高达30%的顺铂耐药性问题，通过识别免疫相关基因差异表达、构建预后评分，并利用体外和体内实验验证了分子化合物Rutin、ICG-001和Doxorubicin对靶向CTLA4、SNX17和TMX1的潜力，这些化合物能有效抑制精原细胞瘤细胞的增殖和侵袭能力，为精原细胞瘤的预后评估和免疫治疗提供了新的策略和潜在治疗候选药物。总的来说，该文的亮点在于补充了体内外的模型，是干湿结合的经典结合方法。
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