01一、文章信息
发表杂志名称：Cell Communication and Signaling
中文标题：衰老成纤维细胞分泌 CTHRC1 促进肝细胞癌的癌症干性
英文标题：Senescent fibroblasts secrete CTHRC1 to promote cancer stemness in hepatocellular carcinoma
影响因子：8.9
发表日期：2025 年 8 月 25日
01二、研究概述
该思路适合结合热点来做，例如小编发现一个新热点。以肿瘤为例，目前肿瘤中有180多篇研究，66篇10+文章，高分率惊人！nature，cancer cell等均报道与免疫逃逸相关。而生信文章几乎没有！
细胞衰老在肿瘤发生发展中意义重大，肿瘤微环境（TME）中主要基质成分癌症相关成纤维细胞（CAFs）会发生衰老，即衰老 CAFs（SCAFs），但其在肝细胞癌（HCC）中的具体作用机制和临床意义尚未明确。作者借助 GSE149614 数据集评估 HCC 的 TME 中细胞衰老状态，结合 CytoTRACE 和细胞间通讯分析探究癌症干性与 SCAFs 的关联，构建 SCAFs 相关风险预测模型。通过单细胞 RNA 测序筛选衰老 CAF 相关基因，整合 TCGA、ICGC、NODE 等数据库的 HCC 基因表达和临床数据，运用四种机器学习算法确定关键基因并建立 CAF 衰老相关风险模型（CSscore），用于预测 HCC 患者预后、癌症干性、免疫浸润、肿瘤突变负荷及治疗反应。同时，通过体内外实验探究胶原三螺旋重复蛋白 1（CTHRC1）在癌症干性中的作用，阐明其下游信号通路，并借助染色质免疫沉淀实验验证关键转录因子与 CTHRC1 启动子区的结合情况。结果显示，HCC 中 CAFs 衰老程度高且与癌症干性密切相关，所建 CSscore 模型可有效预测患者预后，CSscore 与免疫抑制性免疫细胞浸润正相关、与抗肿瘤免疫细胞浸润负相关，低 CSscore 患者肿瘤突变负荷低且对免疫治疗和经导管动脉化疗栓塞反应更佳。此外，SCAFs 中 CTHRC1 高表达，通过 SOX4 - CTHRC1 - Notch1 轴促进 HCC 癌症干性和转移。综上，该研究揭示 SCAFs 与 HCC 癌症干性的关联，建立预测模型并明确 CTHRC1 可作为 HCC 预后和治疗的生物标志物。
01三、研究结果
（一）肝细胞癌肿瘤微环境中衰老 CAFs 的分布及与癌症干性的关联
作者对包含 10 个肿瘤样本的 scRNA - seq 数据集进行分析，经质量控制后获得 33202 个细胞，通过 t - SNE 聚类分析发现细胞在样本间分布均匀，成功去除批次效应（图 1A）；利用已确立的标记基因表达水平对细胞进行注释，识别出 B / 浆细胞、T/NK 细胞、髓系细胞、CAFs、内皮细胞和上皮细胞六种不同细胞类型（图 1B、C）。随后检测经典衰老标志物 p16（CDKN2A）、p21（CDKN1A）和 p53（TP53）在不同细胞类型中的表达模式，发现 p21 和 p53 在内皮细胞中表达最高，p16 主要在 epithelial 细胞中表达（图 S1A）；采用 FRIDMAN_SENESCENCE_UP 特征计算各细胞类型的综合衰老评分，结果显示 CAFs 的衰老评分最高，这与单个标志物的表达模式不同（图 1D），且通过 CellAge 数据库中其他已确立的细胞衰老特征进行验证，也一致表明 CAFs 在独立基因集中具有最高的衰老评分（图 S1B）。为验证 HCC 肿瘤微环境中衰老 CAFs（SCAFs）的存在，作者进行免疫荧光染色识别 SCAFs（α - SMA + p21 + 细胞），结果在肿瘤微环境中观察到 SCAFs，证实了 scRNA - seq 的发现（图 1E）。将 CAFs 根据中位 CAF 衰老评分分为高衰老 CAFs（HS - CAFs）和低衰老 CAFs（LS - CAFs），细胞间通讯分析显示 HS - CAFs 的通讯水平高于 LS - CAFs（图 S1C、D），且 HS - CAFs 中 SASP 介导的信号通路表达水平更高（图 S1E、F）。分析 10 个 HCC 样本中 HS - CAFs 和 LS - CAFs 的相对比例，识别出具有 LS - CAFs 的肿瘤患者（03、09、10）和具有 HS - CAFs 的肿瘤患者（01、02、07）（图 1F）；基因集富集分析（GSEA）表明，来自具有 HS - CAFs 的肿瘤样本的上皮细胞在 “干性细胞上调”“上皮 - 间质转化（EMT）” 和 “多癌侵袭特征” 通路中更富集（图 1G）。将肿瘤细胞分为 Epi1 和 Epi2 亚群（图 S2A - C），使用 CytoTRACE 评估这些亚群的干性程度，发现 Epi2 的干性评分显著高于 Epi1（图 1H），且 HCC 中干性相关基因（如 SOX2、ALDH1A1、CD44 和 MYC）在 Epi2 中高表达，而 Epi1 中与分化相关的基因（如 ALB、GPC3、APOE 和 TF）显著上调（图 S2D）；GSEA 显示，Epi2 中富集了 “上皮 - 间质转化”“肝癌恶性程度”“转化干细胞球” 和 “胎肝成肝细胞” 等干性相关通路（图 S2E）。细胞间通讯分析显示 HS - CAFs 与 Epi2 的通讯显著强于与 Epi1 的通讯（图 1I、图 S2F）。通过差异表达分析（DEG），结合 TCGA - LIHC 数据集中肿瘤与正常组织的差异表达基因，确定了 127 个基因，构建了称为衰老 CAF 相关基因（SCRGs）的基因集（图 S2G、表 S8）；在 CHCC数据集（R = 0.86，p < 2.2e - 16）和 GSE144269 数据集（R = 0.42，p = 3.7e - 07）中，患者水平上 SCAFs（由 SCRGs 代表）和 Epi2（由其特定标记基因代表）的丰度呈显著正相关（图 S2H）。使用单样本基因集富集分析（ssGSEA）计算 SCAF 评分，将患者分为高 SCAFs 组和低 SCAFs 组，GSEA 发现 “干细胞上调”“转移”“干细胞增殖” 和 “干细胞分化调控” 信号通路在高 SCAFs 组中更富集（图 1J）。综上，该部分结果表明 HCC 肿瘤微环境中普遍存在衰老 CAFs，且其与癌症干性密切相关，可能促进 HCC 的发展。
（二）衰老 CAFs 在体内外促进肝细胞癌干性
作者通过免疫荧光分析发现，转移性疾病的 HCC 患者中 SCAFs 的比例显著高于非转移性肿瘤患者（图 2A、图 S3A）；蛋白质印迹分析显示，转移性患者中 p21 的表达增加，癌症干性标志物（CD44、Nanog、Sox2 和 Oct4）和上皮 - 间质转化（EMT）相关蛋白（N - 钙粘蛋白、波形蛋白和 Snail1）的水平也高于非转移性患者（图 S3B）。从人 HCC 组织中提取 CAFs，从肝血管瘤附近的肝组织中获取正常成纤维细胞（NFs），蛋白质印迹和免疫荧光分析显示，与 NFs 相比，CAFs 中 FAP 和 α - SMA 的表达水平升高（图 S3C、D）。使用 H₂O₂诱导 CAF 衰老以触发氧化应激，结果显示 H₂O₂诱导的 SCAFs 表现出更高的 SA - β - Gal 活性，且衰老标志物 p16、p21 和 p53 在 mRNA 和蛋白质水平上的表达均上调（图 2B - D），同时这些 SCAFs 中编码细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶（MMPs）的 SASP 相关基因表达上调（图 2E）。EdU 和集落形成实验证实，用衰老癌症相关成纤维细胞条件培养基（SCAF - CM）处理的肿瘤细胞比用对照组（CAF - CM）处理的肿瘤细胞增殖能力显著增强（图 2F、图 S3E）；Transwell 实验表明，SCAF - CM 处理显著增强了肿瘤细胞的迁移和侵袭能力（图 2G）；球形成实验显示，用 SCAF - CM 处理肿瘤细胞显著增强了其自我更新能力，CCK - 8 细胞毒性实验表明其对索拉非尼的耐药性增强（图 2H、I）；蛋白质印迹分析显示，暴露于 SCAF - CM 的肿瘤细胞中与癌症干性相关和 EMT 相关的基因表达增加（图 2J）。作者还使用顺铂诱导 CAF 衰老，结果显示顺铂诱导的 SCAFs 表现出更高的 SA - β - Gal 活性，且衰老标志物 p16、p21 和 p53 在蛋白质和 mRNA 水平上的表达均上调（图 S4A - C）；集落形成实验、EdU 增殖实验、Transwell 实验、球形成实验和 CCK - 8 细胞毒性实验共同表明，暴露于 SCAF - CM 和顺铂诱导的 SCAF - CM 的肿瘤细胞在增殖、迁移、侵袭、自我更新和对索拉非尼的耐药性方面均表现出增强的能力（图 S4D - H）；蛋白质印迹分析显示，暴露于 SCAF - CM 和顺铂诱导的 SCAF - CM 的肿瘤细胞中与癌症干性相关和 EMT 相关的基因表达增加（图 S4I）。为在体内验证这些发现，作者构建了小鼠原位肝异种移植模型，将小鼠随机分为两组：SNU - 398 加 CAFs 组和 SNU - 398 加 SCAFs 组。接种四周后，SCAF 组的肿瘤肝脏重量显著高于 CAF 组（图 2K），且 SCAF 组中出现肺转移的小鼠数量增加（图 2L）；免疫组化（IHC）染色显示，SCAF 组中 Ki67 +、CD44 + 和波形蛋白 + 细胞的比例增加（图 S5A）；蛋白质印迹分析证实，与对照组相比，SCAF 组肿瘤组织中衰老相关、干性相关和 EMT 相关基因的表达上调（图 S5B）。综上，该部分结果表明衰老 CAFs 在体内外均能促进 HCC 的干性和转移。
（三）基于机器学习构建 CAF 衰老评分预测模型
作者首先进行单变量 Cox 回归分析，从衰老 CAF 相关基因中筛选出 50 个与 HCC 患者生存结果显著相关的基因（图 S6A）。随后使用四种机器学习算法选择候选预后基因，LASSO 算法识别出 15 个基因（图 3A、图 S6B），XGBoost 算法得到 28 个基因（图 3A、图 S6D），随机森林（RF）算法保留了全部 50 个基因（图 3A、图 S6C），梯度提升机（GBM）算法选择了 28 个基因（图 3A、图 S6E）。取这四种算法结果的交集，确定了 10 个关键基因（图 3B），并在 TCGA - LIHC 训练集中通过 Cox 比例风险回归建立了 CAF 衰老评分（CSscore）。根据这 10 个基因的 Cox 系数和 log2（TPM + 1）转换后的表达值计算每个患者的 CSscore，以中位值为界，将 TCGA - LIHC 队列以及两个独立验证队列（ICGC - LIRI 和 CHCC）的患者分为高 CSscore（H - CSscore）组和低 CSscore（L - CSscore）组（图 3C）。Kaplan - Meier 分析表明，在所有三个队列中，较高的 CSscore 与较差的总生存期（OS）显著相关（图 3D）；且高 CSscore 患者在疾病特异性生存期（DSS）、无病间隔期（DFI）、无进展间隔期（PFI）和无复发生存期（RFS）方面的预后始终比低 CSscore 患者差（图 S7A - D）。ROC 曲线分析验证了 CSscore 的预后价值，TCGA - LIHC 队列中 1 年、2 年和 3 年 OS 的 AUC 值分别为 0.79、0.73 和 0.76；ICGC - LIRI 队列中 1 年、2 年和 3 年 OS 的 AUC 值分别为 0.77、0.73 和 0.73；CHCC 队列中 1 年、2 年和 3 年 OS 的 AUC 值分别为 0.75、0.73 和 0.69（图 3E）。限制性平均生存时间（RMST）分析证实，低 CSscore 组比高 CSscore 组具有更长的寿命和更低的死亡率，在 TCGA - LIHC 队列中 7 年时、ICGC - LIRI 队列中 5 年时、CHCC 队列中 3 年时差异显著（图 3F）。综上，该部分结果表明基于 10 个关键基因构建的 CAF 衰老评分预测模型能有效预测 HCC 患者的预后。
（四）CAF 衰老评分与临床特征结合的预后价值分析
作者通过一致性指数（C - index）评估临床病理因素在 HCC 中的预后价值，单变量和多变量 Cox 回归分析表明，在 TCGA - LIHC 数据集中，CSscore 可独立预测 OS、DSS、DFI 和 PFI（图 4A、图 S8A - C）；在 ICGC - LIRI 数据集中，CSscore 可独立预测 OS（图 4B）；在 CHCC 数据集中，CSscore 可独立预测 OS 和 RFS（图 4C、图 S8D），且该预后模型比年龄、性别、临床分期、T 分期和组织学分级等传统临床病理参数更有效。将 CSscore 与临床参数相结合，其预测能力较单个因素显著提高（图 4D）。为最大化临床实用性，作者基于 CSscore 和临床特征为三个队列分别开发了列线图（图 S8E - G）；决策曲线分析证实，借助 CSscore 可获得显著的临床净获益（图 4E）；校准曲线证实，CSscore 在不同风险水平下均具有较强的预测准确性（图 4F）。此外，在 TCGA - LIHC 队列中，CSscore 升高与高级别、更高的临床分期和 T 分期显著相关（图 S8H - J）；在 ICGC - LIRI 队列中，CSscore 升高与更高的 TNM 分期显著相关（图 S8K）；在 CHCC 队列中，CSscore 升高与更高的 BCLC 分期和 TNM 分期显著相关（图 S8L、M）；对所有三个队列中基于临床特征的患者分层进一步支持了这些发现（图 4G）。综上，该部分结果表明 CAF 衰老评分是一个稳健可靠的预后生物标志物，其值升高与 HCC 患者预后不良相关，且与临床特征结合后能更准确地预测患者预后。
（五）CAF 衰老评分相关的生物学机制及免疫浸润分析
作者对 KEGG 和 GO 通路进行功能富集分析，以阐明 CSscore 背后的生物学机制，结果显示 CSscore 在与细胞周期、细胞粘附、细胞外基质（ECM）相关过程和细胞间相互作用相关的基因中富集（图 5A）。对 Hallmark 基因集进行基因集变异分析（GSVA）表明，高 CSscore 组在 PI3K - AKT - mTOR、TGF - β、Notch 和 p53 信号通路中表现出更强的活性（图 5B）；GSEA 进一步验证，与肿瘤增殖、复发、不良生存、干性、EMT、TP53、TNF 和 TGF - β 信号相关的通路在高 CSscore 组中显著富集（图 5C）。作者评估了两个已建立的干性指数，即基于 ssGSEA 的干性指数和 mRNAsi，结果显示 CSscore 与基于 ssGSEA 的干性指数（R = 0.62，p < 0.001）和 mRNAsi（R = 0.22，p < 0.001）均呈正相关（图 5D）。作者采用多种免疫浸润算法评估 SCAFs 对 HCC 肿瘤微环境（TME）的影响，免疫浸润分析显示，CSscore 与免疫抑制性免疫细胞群体（包括 M2 型巨噬细胞、调节性 T 细胞（Tregs）和中性粒细胞）呈正相关，而与抗肿瘤免疫细胞（如 CD8 + T 细胞、树突状细胞（DCs）和 B 细胞）呈负相关（图 5E）。ssGSEA 分析发现，低 CSscore 组中活化的 CD8 + T 细胞、1 型辅助性 T 细胞、自然杀伤 T 细胞和效应记忆 CD8 + T 细胞富集；相反，高 CSscore 组中活化的 CD4 + T 细胞、中央记忆 CD4 + T 细胞和 2 型辅助性 T 细胞富集（图 5F），而这些细胞之前被报道与 HCC 的不良预后相关。通过对 TCGA 队列进行独立的批量反卷积分析，一致表明 SCAFs 丰度较高的样本中免疫抑制性细胞群体（包括 Tregs、M2 型巨噬细胞和中性粒细胞）的浸润增加（图 S9A），而 CD8 + T 细胞的浸润无显著差异（图 S9B）；此外，SCAFs 丰度升高的样本显示出显著更高的免疫功能障碍和免疫排斥评分（图 S9B）。综上，该部分结果表明 SCAFs 与免疫抑制性微环境相关，这种微环境可能促进 HCC 的进展。
（六）CAF 衰老评分与肿瘤突变负荷及治疗反应的关联
作者采用 MATH 算法评估 TCGA-LIHC 数据集中的肿瘤内异质性（ITH），结果显示高 CSscore 组的 MATH 评分更高（图 6A）；进一步分析发现，MATH 评分高的患者比 MATH 评分低的患者 OS 显著更差（图 6B）；将 ITH 与 CSscore 结合分析，高 MATH + 高 CSscore 组患者的预后显著差于低 MATH + 高 CSscore 组（图 6C）。通过突变谱分析，作者在两组中识别出 20 个显著的基因改变，且这些基因改变具有不同的分布模式（图 6D）。为探究 CSscore 与免疫治疗反应的相关性，作者采用 TIP 分析框架评估抗肿瘤免疫，结果显示 CAF 衰老评分与关键免疫过程（包括免疫细胞向肿瘤的浸润（步骤 5）、T 细胞对癌细胞的识别（步骤 6）以及癌细胞的清除（步骤 7））呈显著负相关（图 6E、图 S10A），表明 CSscore 升高与抗肿瘤免疫受损相关。TIDE 算法分析显示，高 CSscore 组的免疫治疗抵抗评分明显更高，提示其免疫治疗反应可能比低 CSscore 组患者更差（图 6F）。为进一步验证 CSscore 对免疫治疗反应的预测价值，作者分析了 IMvigor210 队列，结果显示 CSscore 升高的患者生存期缩短，且对抗 PD-1 免疫治疗的反应降低（图 6G–I）；在黑色素瘤免疫治疗数据集（GSE91061）中也观察到类似结果（图 6J–L）。此外，作者还研究了该预后特征与经导管动脉化疗栓塞（TACE）治疗（中期 HCC 的标准治疗方法）患者治疗结局的相关性，通过 NTP 分析将定义的风险组与 GSE104580 数据集中的 TACE 应答者进行比较，结果表明 CSscore 较低的患者可能从 TACE 治疗中获益更多（图 6M、N）。综上，该部分结果表明 CAF 衰老评分与肿瘤内异质性相关，且可作为预测 HCC 患者免疫治疗和 TACE 治疗反应的潜在指标。
（七）CTHRC1 在肝细胞癌肿瘤微环境中衰老 CAFs 中的表达情况
作者检测了 10 个关键基因在 SCAFs 中的表达，发现与 CAFs 相比，SCAFs 中 SERPINE1、CTHRC1 和 MARCKSL1 的表达显著上调超过 1.5 倍（图 7A）。小提琴图分析显示，MARCKSL1 在 CAFs 和内皮细胞中均广泛表达，而 SERPINE1 和 CTHRC1 在 CAFs 中表达更具特异性（图 7B）。通过分析衰老评分与每个候选基因表达水平的相关性，发现 CTHRC1 与衰老评分的相关性最强，在 TCGA-LIHC 数据集（R=0.50，p<2.2e-16）（图 7C）和 scRNA-seq 数据集（R=0.3，p<2.2e-16）（图 7D）中均呈显著正相关，因此作者选择 CTHRC1 作为深入探索 HCC 衰老相关机制的主要靶点。ELISA 检测结果显示，SCAFs 分泌的 CTHRC1 量更多（图 7E）；免疫荧光分析表明，SCAFs 中 p21 和 CTHRC1 的丰度高于 CAFs（图 7F）；蛋白质印迹分析显示，SCAFs 中 CTHRC1 的表达显著升高（图 7G）；多重免疫组化（mIHC）分析也显示，SCAFs 中 CTHRC1 的表达高于 CAFs（图 7H）。综上，该部分结果表明在 HCC 肿瘤微环境中，衰老 CAFs 中 CTHRC1 的表达水平升高。
（八）衰老 CAFs 来源的 CTHRC1 在体内外促进肝细胞癌干性
作者首先对 CTHRC1 进行 GSEA 功能富集分析，结果显示其在干性和 EMT 通路中显著富集（图 S11A）。通过慢病毒转导在 SCAFs 中敲低 CTHRC1（shCTHRC1），并通过 qRT-PCR、蛋白质印迹和 ELISA 分析验证了敲低效率（图 S11B–D）。EdU 增殖实验和集落形成实验表明，暴露于 shCTHRC1 SCAFs 条件培养基（CM）的肿瘤细胞增殖能力降低（图 S11H、J）；Transwell 实验显示，暴露于 shCTHRC1 SCAF-CM 的肿瘤细胞迁移和侵袭能力下降（图 8A）；球形成实验和 CCK-8 细胞毒性实验表明，这些细胞的自我更新能力和对索拉非尼的耐药性显著降低（图 8B、C）；蛋白质印迹分析显示，与对照组相比，暴露于 shCTHRC1 SCAF-CM 的肿瘤细胞中癌症干性相关和 EMT 相关基因的表达下调（图 8G）。同时，作者通过慢病毒转导在 CAFs 中上调 CTHRC1（OE-CTHRC1），并通过 qRT-PCR、蛋白质印迹和 ELISA 分析验证了过表达效率（图 S11E–G）。EdU 增殖实验、集落形成实验、Transwell 实验、球形成实验和 CCK-8 细胞毒性实验共同表明，暴露于 OE-CTHRC1 CAFs-CM 的肿瘤细胞在增殖、迁移、侵袭、自我更新和对索拉非尼的耐药性方面均表现出增强的能力（图 8D–F、图 S11I、S11K）；蛋白质印迹分析显示，暴露于 OE-CTHRC1 CAF-CM 的肿瘤细胞中癌症干性相关和 EMT 相关基因的表达上调（图 8H）。为进一步探究 CTHRC1 是否直接影响 HCC 干性，作者将 MHCC-97H 和 SNU-398 细胞分别在 DMEM、SCAF-CM、shControl SCAF-CM、shCTHRC1 SCAF-CM 以及添加重组人 CTHRC1 蛋白（rhCTHRC1，20ng/ml）的 DMEM 中培养，随后进行一系列功能实验。结果显示，暴露于 SCAF-CM、shControl SCAF-CM 或 rhCTHRC1 的肿瘤细胞在增殖、迁移、侵袭、自我更新和对索拉非尼的耐药性方面能力增强（图 S12A–E）；蛋白质印迹分析显示，这些细胞中癌症干性相关和 EMT 相关基因的表达上调（图 S12F）。为在体内阐明 CTHRC1 的作用，作者构建了小鼠原位肝异种移植模型，将小鼠随机分为三组：SNU-398 细胞 + SCAF-shCtrl 组、SNU-398 细胞 + SCAF-shCTHRC1-1 组和 SNU-398 细胞 + SCAF-shCTHRC1-2 组。接种四周后，CTHRC1 敲低的 SCAF 组肝脏重量显著降低（图 8I），且肺转移数量减少（图 8J）；IHC 染色结果显示，CTHRC1 敲低的 SCAF 组中 Ki67+、CD44 + 和波形蛋白 + 细胞的比例降低（图 S13A）；蛋白质印迹分析证实，shCTHRC1 SCAF 组肿瘤组织中 CTHRC1、干性相关和 EMT 相关基因的表达降低（图 S13B）。综上，该部分结果表明衰老 CAFs 来源的 CTHRC1 在体内外均可促进 HCC 的干性和转移。
（九）衰老 CAFs 通过 SOX4-CTHRC1-Notch1 轴促进肝细胞癌干性
作者通过 GSEA 分析发现，在 TCGA-LIHC 数据集中，CTHRC1 高表达的患者中 Notch 信号通路显著富集（图 9A）；使用 ssGSEA 算法发现，CTHRC1 的表达与 Notch 通路富集评分呈正相关（图 S14A）；相关性分析证实，CTHRC1 的表达与 Notch 通路关键成分（包括 Notch1、Hes1 和 Hey1）的表达呈正相关（图 S14B）。免疫荧光染色显示，暴露于 shCTHRC1 SCAF-CM 的肿瘤细胞中 Notch1/Notch1 细胞内结构域（NICD）的表达降低（图 S14C）；相反，暴露于 OE-CTHRC1 CAF-CM 的肿瘤细胞中 Notch1/NICD 的表达水平升高（图 S14D）。蛋白质印迹分析表明，shCTHRC1 SCAF-CM 降低了肿瘤细胞中 Notch1、NICD、Hes1 和 Hey1 的表达（图 9B），而 OE-CTHRC1 CAF-CM 则增加了这些 Notch 通路成分的表达水平（图 9C）；此外，作者还验证了在小鼠肿瘤组织中，CTHRC1 敲低会降低 Notch1、NICD、Hes1 和 Hey1 的表达（图 9D）。为阐明 Notch1 信号在 CTHRC1 驱动的肿瘤进展中的作用，作者通过慢病毒转导构建了 Notch1 过表达（OE-Notch1）或敲低（shNotch1）的稳定肿瘤细胞系，并通过 qRT-PCR（图 S15A、B）和蛋白质印迹（图 S15C、D）验证了转导效率。结果显示，在暴露于 shCTHRC1 SCAF-CM 的肿瘤细胞中，OE-Notch1 可部分恢复细胞的增殖（图 S15E、S15H）、迁移、侵袭（图 9E、H、I）和自我更新能力（图 9F、J）；蛋白质印迹分析显示，OE-Notch1 还可恢复肿瘤细胞中干性相关和 EMT 相关基因的表达（图 S15L）。相反，在暴露于 OE-CTHRC1 CAF-CM 的肿瘤细胞中，sh-Notch1 可抑制细胞的增殖（图 S15F、S15I）、迁移、侵袭（图 S15G、S15J-K）和自我更新能力（图 9G、K）；此外，shNotch1 还降低了肿瘤细胞中干性相关和 EMT 相关基因的表达（图 S15M）。作者进一步探究 SCAFs 中 CTHRC1 上调的机制，通过 FIMO_JASPAR、GTRD 和 HumanTFDB 数据库预测与 CTHRC1 相关的转录因子并取交集，确定了 16 个转录因子（图 9L）；相关性分析显示，SOX4 的表达与 CSscore 和 CTHRC1 的表达均呈显著正相关（图 9M）。免疫荧光分析表明，SCAFs 中 p21 和 SOX4 的丰度高于 CAFs（图 9N）；qRT-PCR 和蛋白质印迹分析显示，SCAFs 中 SOX4 的 mRNA 和蛋白质水平均升高（图 9O、P）。通过慢病毒转导在 SCAFs 中构建 SCAF-shCtrl 和 SCAF-shSOX4 细胞系，qRT-PCR 和蛋白质印迹验证了敲低效率（图 9Q、R）；同时，通过慢病毒转导在 CAFs 中上调 SOX4，qRT-PCR 和蛋白质印迹验证了过表达效率（图 9S、T）。结果显示，CTHRC1 的 mRNA 和蛋白质水平随 SOX4 表达的变化而变化（图 9Q–T）；染色质免疫沉淀（ChIP）实验分析表明，SOX4 可结合 CAFs 中 CTHRC1 基因的启动子（图 9U）。综上，该部分结果表明衰老 CAFs 通过 SOX4-CTHRC1-Notch1 轴促进 HCC 的干性。
（十）CTHRC1 表达与 Notch1 通路激活及肝细胞癌临床病理特征的关联
作者从 HCCDB 数据库中分析了 16 个 HCC 队列中 CTHRC1 的表达水平，以 1.5 为阈值将其分为上调和下调，结果显示 51% 的病例中 CTHRC1 在 HCC 中较邻近肝组织上调，而 6.1% 的患者中 CTHRC1 下调（图 10A）；CPTAC 数据集中也观察到 HCC 中 CTHRC1 蛋白高表达（图 10B）；qRT-PCR 和蛋白质印迹实验显示，肿瘤组织中 CTHRC1 的 mRNA 和蛋白质水平显著高于邻近的非肿瘤组织（图 10C、D）。作者通过组织芯片上的 IHC 染色评估了 CTHRC1 与 Notch1/NICD 表达的关系（图 10E），相关性分析表明 Notch1/NICD 与 CTHRC1 表达呈正相关（R=0.57；p=7.1e-06）（图 10F）。UALCAN 数据集分析显示，CTHRC1 表达升高与更晚期的肿瘤分期和更高的组织学分级显著相关（图 10G）；表 1 显示，CTHRC1 高表达与肿瘤低分化和晚期 TNM 分期显著相关。Kaplan-Meier 生存分析表明，CTHRC1 高表达的患者 OS 显著低于 CTHRC1 低表达的患者（p<0.001）（图 10H）；Gene Expression Profiling Interactive Analysis（GEPIA）数据库也证实，CTHRC1 表达较高的 HCC 患者 OS 较短（图 10I）；Cox 回归分析表明，CTHRC1 表达是一个独立的预后因素（表 2）。综上，该部分结果表明 CTHRC1 在肿瘤组织中上调，且与 Notch 通路激活和 HCC 患者较差的临床结局相关。
本研究围绕肝细胞癌（HCC）中衰老癌症相关成纤维细胞（SCAFs）的作用展开，通过多维度实验与分析，系统探究了 SCAFs 对 HCC 癌症干性及疾病进展的影响机制，并构建了具有临床价值的预后模型。研究首先借助 scRNA-seq 数据分析 HCC 肿瘤微环境（TME）中细胞衰老状态，发现癌症相关成纤维细胞（CAFs）衰老程度最高且与癌症干性密切相关；随后通过四种机器学习算法从衰老 CAF 相关基因中筛选出 10 个关键基因，构建了 CAF 衰老评分（CSscore）预后模型，该模型在 TCGA、ICGC、NODE 三个队列中均能有效预测患者预后，且与免疫浸润、肿瘤突变负荷及治疗反应相关，低 CSscore 患者抗肿瘤免疫细胞浸润更多、肿瘤突变负荷更低，对免疫治疗和经导管动脉化疗栓塞（TACE）反应更佳。进一步研究发现，SCAFs 中高表达的胶原三螺旋重复蛋白 1（CTHRC1）是关键效应分子，体内外实验证实 SCAFs 通过分泌 CTHRC1，经 SOX4-CTHRC1-Notch1 轴促进 HCC 的癌症干性、转移及对索拉非尼的耐药性，且 CTHRC1 高表达与 HCC 患者晚期临床分期、低分化及不良预后相关。此外，研究还揭示了 SCAFs 通过营造免疫抑制微环境（富集 M2 型巨噬细胞、调节性 T 细胞等）促进 HCC 进展的机制。综上，本研究不仅阐明了 SCAFs 在 HCC 中的作用及分子机制，还提供了 CSscore 和 CTHRC1 这两个潜在的预后标志物与治疗靶点，为 HCC 的精准诊疗提供了新的理论依据与实践方向
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